生きたマウスにおける血管炎症及び血栓形成の間に活性化内皮上に異型血小板、好中球の相互作用のリアルタイムイメージング
Summary
ここでは、血管の炎症や生きたマウスにおける血栓形成の間に活性化内皮上の異血小板、好中球の相互作用を可視化する蛍光生体顕微鏡の実験手法を報告する。この顕微鏡技術は、血管疾患の分子メカニズムを研究することが、病態生理学的な条件下での薬理学的薬剤をテストするためにも役立ちます。
Abstract
活性化された内皮細胞を媒介血栓症および血管炎症で活性化された血小板と白血球の相互作用（主に好中球）。1,2動脈損傷部位に血栓形成の間、活性化内皮に付着した血小板と内皮下マトリックスタンパク質は、好中球のローリングや接着をサポートしています3逆に、細静脈の炎症性条件の下で、活性化された内皮細胞に付着して好中球が循環する血小板の付着·蓄積をサポートすることができます。異血小板好中球凝集は細胞間の特異的受容体-カウンター受容体の相互作用によってシーケンシャルプロセスを必要とします。4それが活性化された内皮細胞は、それによって高剪断条件下で血小板の接着および蓄積を開始する、そのようなvon Willebrand因子として接着分子を放出することが知られている。5はまた、活性化された内皮細胞は、セレクチン発現させることにより、好中球のローリングとの接着性をサポートD細胞間接着分子-1（ICAM-1）は、それぞれ、低剪断条件下で4血小板P-セレクチンは通って好中球と相互作用するP-セレクチン糖タンパク質リガンド-1（PSGL-1）することにより、好中球β2インテグリンと企業の活性化を誘導する2種類の細胞間の接着。異型の血小板、好中球の相互作用は、全血または単離された細胞、6,7で決定されたin vitroの実験での進歩にもかかわらず、それらの研究では、血管疾患の間に酸化ストレス状態を操作することはできません。本報告では、蛍光標識を使用して、マウス血小板および好中球のマーカーに対する特異的抗体は、我々はTNF-α誘導炎症時に活性化された内皮細胞に血小板や好中球の異型相互作用をモニターするための詳細な生体顕微鏡プロトコルを記述したり、レーザー誘起に続く生きたマウスの精巣挙筋の微小血管の損傷。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、血管の炎症や血栓症の間に活性化内皮上の異血小板、好中球の相互作用を可視化するためのリアルタイム蛍光生体顕微鏡検査のための詳細なプロトコルを記述します。以前、似たような蛍光顕微鏡のアプローチは血栓形成と血管炎症の分子メカニズムを研究することが報告された。8,12異型細胞間の相互作用は、損傷部位での血管閉塞のために重要であるかもしれないので?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、国立衛生研究所からの助成金（JC〜P30のHL101302とRO1 HL109439）とアメリカ心臓協会（JCへSDG 5270005）によって部分的にサポートされていました。 A. BaraziaはT32HL007829 NIHの訓練助成金によって支えられている。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | 144-55-8 | |
| 0.9% NaCl Saline | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd | ||
| Intramedic Tubing (PE 90) | BD Diagnostics | 427421 | |
| Intramedic Tubing (PE 10) | BD Diagnostics | 427401 | |
| Murine TNF-α | R&D Systems | 410-MT | |
| Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody | Emfret Analytics | X488 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody | BioLegend | 108418 | |
| NESLAB EX water bath/circulator | Thermo-Scientific | ||
| Olympus BX61W microscope | Olympus | ||
| TH4-100 Power | Olympus | ||
| Lambda DG-4 | Sutter | ||
| MPC-200 multi-manipulator | Sutter | ||
| ROE-200 stage controller | Sutter | ||
| C9300 high-speed camera | Hamamatsu | ||
| Intensifier | Video Scope International | ||
| Ablation Laser | Photonic Instruments, Inc. | ||
| SlideBook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations |
References
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Nieswandt, B., Kleinschnitz, C., Stoll, G. Ischaemic stroke: a thrombo-inflammatory disease. J. Physiol. 589, 4115-4123 (2011).
- Yang, J., Furie, B. C., Furie, B. The biology of P-selectin glycoprotein ligand-1: its role as a selectin counterreceptor in leukocyte-endothelial and leukocyte-platelet interaction. Thromb. Haemost. 81, 1-7 (1999).
- Zarbock, A., Polanowska-Grabowska, R. K., Ley, K. Platelet-neutrophil-interactions: linking hemostasis and inflammation. Blood Rev. 21, 99-111 (2007).
- Chen, J., Lopez, J. A. Interactions of platelets with subendothelium and endothelium. Microcirculation. 12, 235-246 (2005).
- Konstantopoulos, K., et al. Venous levels of shear support neutrophil-platelet adhesion and neutrophil aggregation in blood via P-selectin and beta2-integrin. Circulation. 98, 873-882 (1998).
- Maugeri, N., de Gaetano, G., Barbanti, M., Donati, M. B., Cerletti, C. Prevention of platelet-polymorphonuclear leukocyte interactions: new clues to the antithrombotic properties of parnaparin, a low molecular weight heparin. Haematologica. 90, 833-839 (2005).
- Hidalgo, A., et al. Heterotypic interactions enabled by polarized neutrophil microdomains mediate thromboinflammatory injury. Nat. Med. 15, 384-391 (2009).
- Cho, J., Furie, B. C., Coughlin, S. R., Furie, B. A critical role for extracellular protein disulfide isomerase during thrombus formation in mice. J. Clin. Invest. 118, 1123-1131 (2008).
- Cho, J., et al. Protein disulfide isomerase capture during thrombus formation in vivo depends on the presence of beta3 integrins. Blood. 120, 647-655 (2012).
- Gross, P. L., Furie, B. C., Merrill-Skoloff, G., Chou, J., Furie, B. Leukocyte-versus microparticle-mediated tissue factor transfer during arteriolar thrombus development. Journal of Leukocyte Biology. 78, 1318-1326 (2005).
- Falati, S., Gross, P., Merrill-Skoloff, G., Furie, B. C., Furie, B. Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse. Nat. Med. 8, 1175-1181 (2002).
- Barthel, S. R., et al. Alpha 1,3 fucosyltransferases are master regulators of prostate cancer cell trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19491-19496 (2009).
- Trzpis, M., McLaughlin, P. M., de Leij, L. M., Harmsen, M. C. Epithelial cell adhesion molecule: more than a carcinoma marker and adhesion molecule. The American Journal of Pathology. 171, 386-395 (2007).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
- Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection. Immunologic Research. 40, 35-48 (2008).
