Aislamiento de líquido cefalorraquídeo de embriones de roedores para su uso con disecados explantes cortical cerebral
Summary
El líquido ventricular cefalorraquídeo (LCR) baña las células de la corteza cerebral y neuroepitelial progenitoras durante el desarrollo temprano del cerebro del embrión. Aquí se describe el método desarrollado para aislar CSF ventricular de embriones de roedores de diferentes edades con el fin de investigar su función biológica. Además, demostramos nuestra disección cerebral cortical explantes y técnica de cultivo que permita el crecimiento de explantes con volúmenes mínimos de medio de cultivo o LCR.
Abstract
El CSF es un fluido complejo con un proteoma que varía dinámicamente durante todo el desarrollo y en la edad adulta. Durante el desarrollo embrionario, la CSF naciente diferencia del líquido amniótico tras el cierre del tubo neural anterior. El volumen de LCR aumenta entonces en los días subsecuentes como las células progenitoras neuroepiteliales que recubren los ventrículos y el plexo coroideo generan LCR. Los embriones de contactos de LCR la apical ventricular superficie de las células madre neurales del cerebro en desarrollo y la médula espinal. CSF proporciona presión de fluido crucial para la expansión del cerebro en desarrollo y distribuye crecimiento importante promoción de los factores de las células progenitoras neurales de una manera temporal específica. Para investigar la función de los CSF, es importante aislar muestras puras de embrionario CSF sin contaminación de la sangre o del tejido en desarrollo telencephalic. Aquí se describe una técnica para aislar muestras relativamente puras de CSF del ventrículo embrionario que se pueden utilizar parauna amplia gama de ensayos experimentales, incluyendo la espectrometría de masas, electroforesis de proteínas, y cultivo de células y explante primario. Se demuestra cómo diseccionar y cultura explantes corticales en membranas porosas de policarbonato con el fin de crecer tejido en desarrollo cortical con volúmenes reducidos de los medios de comunicación o CSF. Con este método, los experimentos se pueden realizar utilizando CSF de diferentes edades o condiciones para investigar la actividad biológica de la proteoma CSF en las células diana.
Introduction
El líquido cefalorraquídeo es un líquido complejo que baña el neuroepitelio desarrollo 1-6 y ofrece 7 Presión esencial y la promoción del crecimiento claves para el desarrollo del cerebro 8-12. Para estudiar el CSF en el curso del desarrollo del cerebro, hemos desarrollado técnicas para aislar CSF del ventrículo desde el desarrollo de embriones de rata o ratón durante varias etapas de desarrollo 6,9. Los métodos anteriores de aislamiento incluyó el uso de un cristal de micro-aguja y aislar el CSF utilizando un micro-inyector de 1,2. Nuestro método utiliza un vaso capilar micro-pipeta cuya punta se ha tirado para crear un punto de penetración en el tejido ultrafino mejorada. El cristal de micro-pipeta capilar está conectado a un aspirador de modo que para obtener el LCR ventricular se puede controlar con cambios suaves en la presión. Para investigar la influencia de células madre de señales de LCR, se diseccionan cerebrales corticales explantes, colocarlos en las membranas de policarbonato y flotar sobre ellos cu apropiadaslture medio suplementado con muestras de LCR 9. Con esta técnica, los volúmenes reducidos de medios son suficientes para el cultivo de tejidos, lo que permite un uso eficiente de los CSF 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito para la recolección de líquido cefalorraquídeo ventricular ha dado muestras relativamente puras de CSF embrionario con la composición de proteína estable y la actividad consistente en una serie de ensayos celulares 9. Con una técnica buena colección y tamaño de la camada de diez ratones E14.5, se puede esperar para cobrar 10-15 l de LCR y de una camada de ratas E16, se puede esperar para recoger alrededor de 50-90 l de LCR. Esta técnica minimiza la contaminación de recogida de la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos muy agradecidos por el apoyo del NIH (R00 NS072192 números Premio a MKL, HD029178 a AS.L., y 2 RO1 NS032457 a CAW). MKL ha recibido del Hospital Infantil de Boston Career Fellowship Desarrollo de la Confraternidad / Harvard Medical School Shore y un compañero de la Alfred P. Sloan Foundation. CAW es un investigador del Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Wiretrop II capillary needles | Drummond Scientific | #5-000-2020 | |
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | #184 SIL ELAST kit | |
| Aspirator tube assembly | Sigma | #A5177-5EA | |
| Disposable filter | Venturi or local pharmacy | not available | Standard cigarette filter |
| Roundstock opthalmic knife (15 degree stab knife) | World Precision Instruments, Inc. | #500250 | |
| 35mm glass bottomed culture dish | MatTek Corp. | #P35G-1.5-14-C | |
| Platinum-iridium wire | Tritech Research | #PT-9010-010-3FT | |
| Nuclepore Track-Etch Membrane | Whatman | #09-300-57 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Fisher Scientific | #SH30031.FS | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | #15000-02 |
References
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