Isolering af cerebrospinalvæske fra Gnaver Embryoner til brug med dissekeret Cerebral Cortikale Eksplantater

Summary

Den ventrikulære cerebrospinalvæske (CSF) bader neuroepitelceller og cerebral cortical progenitorceller under tidlig hjernens udvikling i embryoet. Her beskrives fremgangsmåden udviklet til isolering af ventrikulær CSF fra gnavere embryoner i forskellige aldre for at undersøge dets biologiske funktion. Derudover viser vi vores cerebral kortikal eksplantat dissektion og dyrkning teknik, der giver mulighed for eksplantat vækst med minimale volumen af ​​kulturmedium eller CSF.

Abstract

CSF er en kompleks væske med en dynamisk varierende proteom hele udviklingen og i voksenlivet. Under embryonisk udvikling, adskiller den spirende CSF fra fostervandet ved lukning af den forreste neuralrøret. CSF volumen stiger derefter i de efterfølgende dage som de neuroepitelceller progenitorceller foring hjertekamrene og choroid plexus generere CSF. De embryoniske CSF kontakter den apikale, ventrikulære overflade af de neurale stamceller i den udviklende hjerne og rygmarv. CSF giver afgørende fluidtryk til udvidelse af den udviklende hjerne og distribuerer vigtige vækstfremmende faktorer til neurale progenitorceller i en tidsmæssigt specifik måde. At undersøge funktionen af ​​CSF, er det vigtigt at isolere rene prøver af embryonisk CSF uden kontaminering fra blod eller udviklingslandene telencephalic væv. Her beskriver vi en teknik til at isolere relativt rene prøver af ventrikulær embryonisk CSF, der kan anvendes tilen lang række eksperimentelle assays, herunder massespektrometri, protein elektroforese og celle og primære eksplantat kultur. Vi viser, hvordan man dissekere og kultur kortikale eksplantater på porøse polycarbonatmembraner for at vokse udvikle cortexvæv med reducerede mængder af medier eller CSF. Med denne metode kan forsøg udføres under anvendelse af CSF fra forskellige aldre eller tilstande at undersøge den biologiske aktivitet af CSF proteomet på målceller.

Introduction

CSF er en kompleks væske, der bader udviklingslandene neuroepithelium ^1-6 og giver væsentlig tryk ⁷ og vækstfremmende signaler til hjernens udvikling ^8-12. For at undersøge CSF i løbet af hjernens udvikling, vi udviklet teknikker til at isolere ventrikulær CSF i at udvikle rotte-eller muse embryoer på forskellige udviklingsstadier ^6,9. Tidligere fremgangsmåder til isolering inkluderet under anvendelse af en glas mikronål og isolering af CSF ved anvendelse af en mikro-injektor ^1,2. Vores fremgangsmåde anvender et glas mikro-kapillær pipette hvis spids er trukket for at skabe en ultrafin for forbedret vævspenetration. Glasset mikro-kapillære pipette er forbundet til en aspirator så ventrikulær CSF samling kan styres med blide trykændringer. For at undersøge stamceller påvirkninger af CSF-signaler, vi dissekere cerebrale kortikale eksplantater, placere dem på polycarbonatmembraner, og flyde dem på passende culture medium suppleret med CSF-prøver ^9. Med denne teknik er reducerede volumener af alle tilstrækkelige til dyrkning af væv, giver mulighed for en effektiv udnyttelse af CSF ^9.

Protocol

1. Embryo Isolation / præparat Denne teknik kan anvendes til mus eller rotte. I denne protokol vi vise FSR indsamling teknik og cerebral cortical eksplantat dissektion med muse embryonale hjerne. Vi vil kommentere eventuelle væsentlige forskelle for rotter versus mus, der findes inden for de generelle teknikker. For det embryoniske alder staging system, er E1 klassificeret som dagen af ​​proppen for rotter, og E0.5 er klassificeret som dagen af ​​proppen for mus. Forbere…

Representative Results

CSF indsamling bør give en klar og gennemsigtig væske. Der bør ikke være noget bevis for kontaminering fra blod, hvilket fremgår af en rød eller gul farvet fluidum i indsugningsstillingen, og i Eppendorf-rør. Der bør også være tegn på væv i indsugningsstillingen, og Eppendorf-rør. Når CSF centrifugeres, kan man også vurdere CSF mikroskopisk at sikre, at der ikke er nogen forurening. Hvis der er tegn på kontaminering bør CSF kasseres. Fra den ene E14.5 mus kuld, kan man forudse at indsamle 10-15 gl CSF. …

Discussion

Den beskrevne fremgangsmåde til ventrikulær CSF samling har givet forholdsvis rene prøver af embryonisk CSF med stabilt protein sammensætning og ensartet aktivitet i en række cellulære assays ^9. Med en god samling teknik og kuldstørrelse af ti E14.5 mus, kan man forvente at indsamle 10-15 pi CSF, og fra et kuld på E16 rotter, kan man forvente at indsamle omkring 50-90 ul CSF. Denne samling teknik minimerer kontaminering fra blod og væv, ved omhyggelig observation, centrifugering og kassation af prøv…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Wiretrop II capillary needles	Drummond Scientific	#5-000-2020
Sylgard	Ellsworth Adhesives	#184 SIL ELAST kit
Aspirator tube assembly	Sigma	#A5177-5EA
Disposable filter	Venturi or local pharmacy	not available	Standard cigarette filter
Roundstock opthalmic knife (15 degree stab knife)	World Precision Instruments, Inc.	#500250
35mm glass bottomed culture dish	MatTek Corp.	#P35G-1.5-14-C
Platinum-iridium wire	Tritech Research	#PT-9010-010-3FT
Nuclepore Track-Etch Membrane	Whatman	#09-300-57
Hanks Balanced Salt Solution	Fisher Scientific	#SH30031.FS
Iridectomy Scissors	Fine Science Tools	#15000-02