Isolering av spinalvæske fra Rodent embryo for bruk med dissekert Cerebral Kortikale explants
Summary
Den ventrikulære cerebrospinalvæsken (CSF) bader neuroepithelial og cerebral kortikale stamceller under tidlig utvikling av hjernen i embryoet. Her beskriver vi en metode utviklet for å isolere ventrikulær CSF fra gnagere embryoer i ulike aldre for å undersøke sin biologiske funksjon. I tillegg viser vi vår cerebral cortical eksplantering disseksjon og kultur teknikk som gjør det mulig for eksplantering vekst med minimale mengder kultur medium eller CSF.
Abstract
CSF er en kompleks væske med en dynamisk varierende proteom hele utvikling og i voksen alder. Under embryonal utvikling, skiller den gryende CSF fra fostervannet på nedleggelse av fremre nevralrøret. CSF-volum øker deretter i kommende dager som neuroepithelial stamceller lining ventriklene og årehinnen plexus generere CSF. De embryoniske CSF kontakter den apikale, ventrikulær overflate av neural stamceller utviklingen av hjernen og ryggmargen. CSF gir avgjørende fluidtrykk for utvidelse av utviklingen av hjernen og distribuerer viktig vekstfremmende faktorer til neurale progenitorceller i temporært-spesifikk måte. For å undersøke funksjonen av CSF, er det viktig å isolere rene prøver av embryonale CSF uten forurensning fra blod eller utviklingsland telencephalic vev. Her beskriver vi en teknikk for å isolere relativt rene prøver av ventrikulær embryonale CSF som kan brukes foret bredt spekter av eksperimentelle tester, inkludert massespektrometri, protein elektroforese, og celle og primær eksplantasjon kultur. Vi viser hvordan å dissekere og kultur kortikale explants på porøse polykarbonatmembraner for å vokse utvikle cortical vev med reduserte volumer av media eller CSF. Med denne metoden kan eksperimenter utføres med CSF fra varierende aldre eller lidelser undersøke den biologiske aktivitet av CSF proteomet på målceller.
Introduction
CSF er en kompleks væske som bader utvikle neuroepithelium 1-6 og gir viktig press 7 og vekstfremmende pekepinner for utviklingen av hjernen 8-12. Å studere CSF i løpet av hjernens utvikling, har vi utviklet teknikker for å isolere ventrikulær CSF fra utviklingsland rotte eller mus embryoer under ulike stadier av utviklingen 6,9. Tidligere metoder for isolasjon inkluderte å bruke et glass mikro-nål og isolere CSF ved hjelp av en mikro-injektor 1,2. Vår metode benytter en glass mikro-kapillær pipette hvis spissen er trukket for å skape en ultrafin punkt for forbedret vev penetrasjon. Glasset mikro-kapillær pipette er koblet til en aspirator, slik at ventrikulær CSF samlingen kan kontrolleres med milde endringer i trykket. Å undersøke stamcelle påvirkninger av CSF signaler, dissekere vi cerebrale kortikale explants, plassere dem på polykarbonatmembraner, og flyte dem på passende cuLTURE medium supplert med CSF prøver 9. Med denne teknikken, reduserte mengder media er tilstrekkelig til kultur vevet, slik at for en effektiv bruk av CSF 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrevne fremgangsmåte for ventrikulær CSF samlingen har gitt relativt rene prøver av embryonale CSF med stabil proteinkvalitet og konsekvent aktivitet i en rekke cellulære analyser 9. Med en god samling teknikk og kullstørrelse av ti E14.5 mus, kan man forvente å samle 10-15 ul CSF, og fra et kull på E16 rotter, kan man forvente å samle ca 50-90 ul CSF. Denne samlingen teknikken reduserer forurensning fra blod og vev, ved nøye observasjon, sentrifugering, og utkast av prøver med noen bevis for…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige for støtten fra NIH (Award tall R00 NS072192 til MKL, HD029178 til AS.L., og 2 RO1 NS032457 til CAW). MKL er mottaker av Barnas Hospital Boston Karriereutvikling Fellowship / Harvard Medical School Shore Fellowship og en Fellow av Alfred P. Sloan Foundation. CAW er en etterforsker av Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Wiretrop II capillary needles | Drummond Scientific | #5-000-2020 | |
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | #184 SIL ELAST kit | |
| Aspirator tube assembly | Sigma | #A5177-5EA | |
| Disposable filter | Venturi or local pharmacy | not available | Standard cigarette filter |
| Roundstock opthalmic knife (15 degree stab knife) | World Precision Instruments, Inc. | #500250 | |
| 35mm glass bottomed culture dish | MatTek Corp. | #P35G-1.5-14-C | |
| Platinum-iridium wire | Tritech Research | #PT-9010-010-3FT | |
| Nuclepore Track-Etch Membrane | Whatman | #09-300-57 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Fisher Scientific | #SH30031.FS | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | #15000-02 |
References
- Dziegielewska, K. M., Evans, C. A., Lai, P. C., Lorscheider, F. L., Malinowska, D. H., Mollgard, K., Saunders, N. R. Proteins in cerebrospinal fluid and plasma of fetal rats during development. Developmental Biology. 83 (1), 193-200 (1981).
- Gato, A., Martin, P., Alonso, M. I., Martin, C., Pulgar, M. A., Moro, J. A. Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos. Journal of Experimental Zoology. Part A, Comparative Experimental Biology. 301 (4), 280-289 (2004).
- Gato, A., Moro, J. A., Alonso, M. I., Bueno, D., Mano, D. L., Martin, C. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 284 (1), 475-484 (2005).
- Parada, C., Gato, A., Aparicio, M., Bueno, D. Proteome analysis of chick embryonic cerebrospinal fluid. Proteomics. 6 (1), 312-320 (2006).
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome. Journal of Proteome Research. 4 (6), 2420-2428 (2005).
- Zappaterra, M. D., Lisgo, S. N., Lindsay, S., Gygi, S. P., Walsh, C. A., Ballif, B. A. A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid. Journal of Proteome Research. 6 (9), 3537-3548 (2007).
- Desmond, M. E., Jacobson, A. G. Embryonic brain enlargement requires cerebrospinal fluid pressure. Developmental Biology. 57 (1), 188-198 (1977).
- Lehtinen, M. K., Walsh, C. A. Neurogenesis at the brain-cerebrospinal fluid interface. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 653-679 (2011).
- Lehtinen, M. K., Zappaterra, M. W., Chen, X., Yang, Y. J., Hill, A. D., Lun, M., Maynard, T., Gonzalez, D., Kim, S., Ye, P., et al. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69 (5), 893-905 (2011).
- Martin, C., Alonso, M. I., Santiago, C., Moro, J. A., De la Mano, A., Carretero, R., Gato, A. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. International Journal of Developmental Neuroscience: The Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 27 (7), 733-7340 (2009).
- Martin, C., Bueno, D., Alonso, M. I., Moro, J. A., Callejo, S., Parada, C., Martin, P., Carnicero, E., Gato, A. FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells. Developmental Biology. 297 (2), 402-416 (2006).
- Zappaterra, M. W., Lehtinen, M. K. The cerebrospinal fluid: regulator of neurogenesis, behavior, and beyond. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 69 (17), 2863-2878 (2012).
