कृंतक श्वासनली epithelia में सिलिया गतिशीलता के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए पूर्व vivo विधि
Summary
एयरवे सिलिया गतिशीलता और सिलिया उत्पन्न प्रवाह माउस श्वासनली का उपयोग कर visualizing और बढ़ाता के लिए एक आसान और विश्वसनीय तकनीक का वर्णन किया है. इस तकनीक कारकों की एक विस्तृत श्रृंखला औषधीय एजेंटों, आनुवांशिक कारक, पर्यावरण जोखिम, और / या ऐसे बलगम लोड के रूप में यांत्रिक कारकों सहित, सिलिया गतिशीलता को प्रभावित कैसे निर्धारित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
Abstract
Mucociliary निकासी समारोह में अंतर्दृष्टि के लिए महत्वपूर्ण चलता – फिरता cilia समारोह के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए इमेजिंग माउस एयरवे epithelia के लिए एक पूर्व vivo तकनीक स्थापित किया गया है. हौसले से काटा माउस ट्रेकिआ trachealis मांसपेशियों के माध्यम से अनुलंबीय कटौती और एक गिलास तली पकवान पर एक उथले घिरी कक्ष में रखा गया है. श्वासनली नमूना अनुलंबीय कर्ल trachealis मांसपेशियों का लाभ लेने के लिए अपने लंबे अक्ष के साथ तैनात है. इस पूरे सांस की नली लंबाई के साथ प्रोफ़ाइल में सिलिअरी गति की इमेजिंग की अनुमति देता है. 200 फ्रेम / सेकंड पर वीडियो सिलिया हरा आवृत्ति और सिलिअरी तरंग की मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देने के लिए अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी और एक उच्च गति डिजिटल कैमरे का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं. इमेजिंग के दौरान फ्लोरोसेंट मोती के अलावा के साथ, सिलिया उत्पन्न द्रव का प्रवाह भी निर्धारित किया जा सकता है. प्रोटोकॉल समय चैम्बर तैयारी के लिए 5 मिनट के साथ लगभग 30 मिनट, नमूना के लिए 5-10 मिनट तक फैलाबढ़ते, और videomicroscopy के लिए 10-15 मिनट.
Introduction
एयरवे epithelia में चलता – फिरता cilia समारोह का विश्लेषण mucociliary निकासी और फेफड़े के स्वास्थ्य 1 को प्रभावित कर सकते हैं कि आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों elucidating के लिए प्रयोगात्मक महत्वपूर्ण है. इमेजिंग माउस एयरवे epithelia के लिए विकसित सरल प्रोटोकॉल उत्परिवर्ती और पीटकर माउस मॉडल में airway सिलिया गतिशीलता पूछताछ के लिए एक कारगर तरीका प्रदान करता है और माउस सांस की नली ऊतक विच्छेदन और उच्च संकल्प videomicroscopy साथ airway सिलिया गतिशीलता के पूर्व vivo इमेजिंग में केवल बुनियादी कौशल की आवश्यकता होती है. इस प्रोटोकॉल heterotaxy 2-5 से जुड़े जन्मजात हृदय रोग के साथ म्यूटेंट में चलता – फिरता cilia समारोह का तेजी से मूल्यांकन (सिलिया हरा आवृत्ति, सिलिया हरा आकार, सिलिया उत्पन्न प्रवाह) की अनुमति देने के लिए एक बड़े पैमाने पर माउस mutagenesis के स्क्रीन के दौरान स्थापित और परिष्कृत किया गया.
एयरवे सिलिया गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल वर्तमान तकनीकों तीव्र पूर्व vivo प्रकार या लंदन या तो में बांटा जा सकताइन विट्रो प्रयोगात्मक दृष्टिकोण में प्रासंगिकता शब्द. एक्यूट प्रयोगों पूर्व vivo मानव नाक / एयरवे ब्रश बायोप्सी के दृश्य 6,7 और सरल अनुप्रस्थ एयरवे वर्गों 8 का विश्लेषण शामिल हैं. में इन विट्रो दृष्टिकोण ऐसी हवा तरल इंटरफेस संस्कृतियों या एयरवे निलंबन संस्कृतियों 9-11 के रूप में विभेदित रोमक epithelia की चादरें उत्पन्न करने के लिए विभिन्न सेल कल्चर तकनीक का उपयोग. किसी भी उपयोगी रोमक उपकला कोशिकाओं प्रयोग (4-6 सप्ताह 9,10) के लिए उत्पादन कर रहे हैं हालांकि, इससे पहले इन एयरवे epithelia reciliation तकनीक समय और प्रशिक्षण में बहुत महत्वपूर्ण निवेश की आवश्यकता होती है. Airway उपकला ब्रश बायोप्सी की तीव्र पूर्व vivo विश्लेषण सामान्यतः मानव नैदानिक अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है, इस विधि exacerbated यांत्रिक ऊतक चोट 12 की वजह से माउस अध्ययन में प्रयोग करने योग्य नहीं है.
समझौता ज्ञापनों के विश्लेषण के लिए इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित तकनीकई सांस की नली एयरवे epithelia निष्पादित करने के लिए ही सरल नहीं है, लेकिन यह विशेष विच्छेदन कौशल और न ही videomicroscopy द्वारा इमेजिंग के लिए उन मानक के अलावा किसी भी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है. इस सरल प्रोटोकॉल के कई फायदे हैं. माउस ट्रेकिआ ऊतक फसल प्रदर्शन करने के लिए त्वरित और आसान है के रूप में सबसे पहले, यह चूहों की एक बड़ी संख्या में airway सिलिया समारोह का तेजी से मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है. यह इन विट्रो उपचार में अलग से अल्पकालिक प्रभाव के तीव्र विश्लेषण शामिल कर सकते हैं. दूसरा, एक पूर्व vivo तकनीक जा रहा है, रोमक एयरवे उपकला यह समर्थन ऊतकों अंतर्निहित के साथ संलग्न रहता है और इस तरह जुड़े सेल संकेत दे रास्ते बरकरार रहती है. इसलिए इन विट्रो reciliated एयरवे epithelia में की तुलना में, इस तैयारी विवो ऊतक वातावरण में प्राकृतिक का एक बेहतर प्रतिनिधित्व है. तीसरा, इस प्रोटोकॉल की अनुमति देता है चलता – फिरता सिलिया च का वस्तुपरक मूल्यांकन प्रदान कर सकते हैं कि विभिन्न मात्रात्मक मापदंडों के एक नंबर का अधिग्रहणगर्मजोशी. अंत में, एयरवे सिलिया दृश्य के लिए अन्य मौजूदा तरीकों के विपरीत, इस प्रोटोकॉल सिलिया हरा के उच्च संकल्प इमेजिंग और metachronal लहर पीढ़ी के लिए इष्टतम है कि सिलिया की प्रोफाइल देखने के लिए अनुमति देता है, सिलिया हरा दिशा को सही कोण पर सिलिया के दृश्य के लिए अनुमति देता है .
इस प्रोटोकॉल ऐसे औषधीय एजेंटों, आनुवांशिक कारक, पर्यावरण जोखिम, और / या के एयरवे cilia समारोह और पीढ़ी / रखरखाव पर इस तरह के बलगम लोड के रूप में यांत्रिक कारकों की भूमिका के रूप में प्रयोगात्मक आवश्यकताओं की एक विस्तृत श्रृंखला का पता करने के तरीकों की एक संख्या में संशोधित किया जा सकता है एयरवे सिलिया हरा और metachronal लहर प्रसार.
Protocol
Representative Results
Discussion
सिलिया हरा आवृत्ति का मापन (CBF) उच्च शक्ति माइक्रोस्कोप उद्देश्यों और तेजी से छवि अधिग्रहण हार्डवेयर 13,15 का उपयोग करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है, और CBF माप स्वास्थ्य और बीमारी के दौरान mucociliary निकासी की ज…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
परियोजना राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान से NIH अनुदान U01HL098180 द्वारा समर्थित किया गया था. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और जरूरी राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है और रक्त संस्थान या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012″ (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
References
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