Assembleia da nucleosomal Arrays de recombinantes Núcleo Histones e Nucleosome Posicionamento DNA

Resumo

Um método é apresentado para a reconstituição do modelo matrizes nucleossomais de histonas centrais recombinantes e de DNA em tandem repetido posicionamento nucleosome. Nós também descrevem como experimentos de velocidade de sedimentação na ultracentrífuga analítica, e microscopia de força atômica (AFM) são usados ​​para monitorar o grau de saturação disposição nucleosomal após a reconstituição.

Resumo

Octâmeros histonas centrais que são espaçadas repetitivamente ao longo de uma molécula de DNA são chamados de matrizes nucleossomais. Matrizes nucleossomais são obtidos de uma de duas maneiras: a purificação de fontes in vivo, ou a reconstituição in vitro a partir de histonas de núcleo e de ADN recombinante em tandem repetido posicionamento nucleossoma. O último método tem a vantagem de permitir a montagem de uma mais uniforme em termos de composição e matriz nucleossomal precisamente posicionado. Experiências de velocidade de sedimentação em a informação analítica rendimento ultracentrífuga sobre o tamanho ea forma das macromoléculas através da análise da velocidade à qual elas migram através de uma solução sob a força centrífuga. Esta técnica, juntamente com a microscopia de força atómica, podem ser usadas para controlo de qualidade, garantir que a maior parte dos moldes de ADN são saturados com nucleossomas após reconstituição. Aqui nós descrevemos os protocolos necessários para reconstituir quantidades de miligramas de comprimento e de composição dmatrizes nucleossomais efined adequados para estudos bioquímicos e biofísicos da estrutura e função da cromatina.

Introdução

Genomas eucarióticos não existir como DNA nu, mas sim são compactadas e organizada por proteínas ligadas. Estes complexos de ADN e de proteínas são conhecidos como cromatina. A unidade de repetição básica de cromatina é o nucleossoma. Um nucleossoma é constituído por octâmero histona e 146 pares de bases de ADN envolvida em torno da histona octâmero cerca de 1,6 vezes ^uma. O octâmero histona é composto por duas cópias de cada um dos H2A histonas centrais, H2B, H3, e H4. Octâmeros histonas centrais que são espaçadas repetitivamente ao longo de uma molécula de DNA são chamados de matrizes nucleossomais. A estrutura estendida de matrizes nucleossomais tem sid....

Protocolo

1. Assembléia dos recombinantes Núcleo Histones em octâmeros

Justificativa: O primeiro passo para nucleosomal reconstituição matriz é preparar octâmeros histonas centrais nativas da liofilizados histonas centrais recombinantes. Proteínas histona são combinados em quantidades equimolares e montadas em octâmeros histonas por diálise das amostras de um tampão de desnaturação em tampão de redobragem.

1. Purifica-se e liofiliza histonas centrais recombinantes (H2A, H2B, H3, H4), tal como descrito ^13.
2. Dissolve-se cerca de 5 mg de cada grupo de histonas liofilizado em 3 ml de tampão de revelação (6 M de guanidina HCl....

Resultados

Para ilustrar o protocolo que reconstituído matrizes nucleossomais recombinantes de histonas de núcleo de Xenopus e de ADN consistindo em 12 conjunto 207 repete pb da sequência de posicionamento 601 (601 ²⁰⁷ x 12). O primeiro montado octâmeros nativas de histonas de núcleo liofilizados e, em seguida, purificado os octâmeros por FPLC usando uma coluna S200 (Figura 1A). Complexos maiores eluir mais cedo a partir da coluna S200. As histonas geralmente eluir nesta ordem: agregados histon.......

Discussão

Matrizes nucleossomais modelo são uma ferramenta muito útil para o estudo in vitro da estrutura e função da cromatina. Por exemplo, eles têm sido amplamente utilizado para estudar o mecanismo da condensação de cromatina na fibra solução ^30-34, e tornou possível a obtenção de uma estrutura de raios-x de um tetranucleosome ^35. Mais recentemente, eles têm se mostrado útil para decifrar os efeitos estruturais de variantes de histonas núcleo específico, mutantes e modificações pós-translacionai.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
(3-aminopropil) trietoxissilano	Sigma-Aldrich	A3648-100ML
6-8 kDa MWCO Tubulação de diálise	Fisher	21-152-5
HiLoad Superdex 200 16/60 coluna	GE	17-1069-01
Vivaspin 50 kDa MWCO Concentrador centrífugo	Sartorius	VS2031
12-14 kDa MWCO Tubulação de diálise	Fisher	08-667A
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine	GE	17-0476-01
XL-A/I Ultracentrífuga	Analítica Beckman-Coulter