TruTip er en simpel nukleinsyre udvinding teknologi, hvor en porøs, monolitisk bindingsmatrix indsættes i en pipettespids. Følgelig prøveforberedelsen formatet er kompatibelt med de fleste væskehåndteringssystemer instrumenter, og kan anvendes til mange medium til høj-throughput kliniske anvendelser og prøvetyper.
TruTip er en simpel nukleinsyre udvinding teknologi, hvor en porøs, monolitisk bindingsmatrix indsættes i en pipettespids. Geometrien af monolit kan tilpasses til specifikke pipettespidser spænder i volumen 1,0-5,0 ml. Den store porøsitet af monolitten muliggør viskøse eller komplekse prøver at passere let igennem det med minimal fluid modtryk. Tovejs flow maksimerer opholdstid mellem monolit og prøve, og muliggør store prøvevolumener skal behandles inden for en enkelt TruTip. De grundlæggende trin, uanset prøvevolumen eller TruTip geometri, omfatter cellelyse, nukleinsyrebinding til de indre porer TruTip monolit, vask væk ubundne prøvekomponenter og lysis buffere, og eluering oprensede og koncentrerede nukleinsyrer i en passende puffer. De attributter og tilpasningsevne TruTip er påvist i tre automatiseret klinisk prøve forarbejdning protokoller ved hjælp af en Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR og STARplus væskehåndteringssystemer robotter, herunder RNA isoleret fra nasopharyngeal aspirat, genomisk DNA isoleret fra fuldblod, og føtal DNA-ekstraktion og berigelse fra store mængder af moderens plasma (henholdsvis).
Nukleinsyreoprensning er nødvendig for de fleste molekylær diagnostik, brug udelukkende forskning, og life science applikationer. Forskellige tilgange er dukket siden tidspunktet for phenol / chloroformekstraktioner, hvoraf mange er baseret på det grundlæggende princip om nukleinsyre binding til silica i tilstedeværelse af chaotropiske salte 1.. Udvindingen processen har været strømlines og automatiseres gennem brug af forskellige perle-og membran-baserede formater, med spin-filtre, magnetiske perler og lignende metoder dominerer life science industrien (se eksempler i 2-13). Mens effektive, har partikler og membraner kendte begrænsninger, når de konfronteres med udfordrende kliniske matricer. For eksempel er membraner og perle-baserede kolonner kompatibel, har små pore størrelser (dermed høje modtryk), og kræver en vis form for støtte for at blive behandlet af en centrifuge eller vakuum system. De fysiske egenskaber af membraner og perle kolonner resultere isignifikant strømningsteknisk modstand, hvilket begrænser den type prøver, der effektivt kan behandles uden at tilstoppe den spiselige, og / eller den samlede (input) prøvevolumen, der kan være uni-retningsbestemte behandles gennem strømningsvejen. Omvendt må magnetiske partikler fordeles over hele prøven ved omrøring. Behovet for homogent distribuere magnetiske partikler i en opløsning begrænser det samlede input prøvevolumen, der kan behandles med de fleste magnetiske perle forbrugsvarer. Klinisk prøve attributter (såsom viskositet eller kompleksitet) kan føre til ineffektive magnetisk partikelkoncentration på siden af et rør eller en stang. Desuden kan silica fine partikler brække af perlerne under udpakningen, at miste deres magnetisering og forurener den endelige stikprøve.
Den TruTip teknologi blev udviklet for at overvinde nogle af disse nukleinsyreprøve forarbejdning begrænsninger og begrænsninger 14.. Ved at integrere en porøs monolit i enpipettespids strømningsteknisk modtryk sænkes, hvilket muliggør flowstyring ved vakuum (dvs. pipette aspiration). Denne funktion giver udvindingsprocessen og instrumentering kræves for at oprense nukleinsyrer fra vanskelige prøvetyper der skal forenkles (figur 1). Geometri og porøsitet af skiven er skræddersyet til at minimere tilstopning, mens tykkelsen af monolitten tilvejebringer tilstrækkelig nukleinsyre bindingskapacitet for prøvevolumener spænder fra 1,0 til 5,0 ml. Tovejsstrømning under prøven aspiration og dispensering giver mulighed for længere opholdstider mellem proevekstraktet og bindende monolit til effektiv nukleinsyre nyttiggørelse og eluering og muliggør relativt store prøvevolumener skal behandles som overstiger den mængde kapacitet pipettespidsen selv. Vi har tidligere rapporteret udvikling og anvendelse af en manuel TruTip procedure for rensning influenza RNA fra nasopharynx prøver ved hjælp af en enkelt eller multi-kanal Rainin pipettor 15.. Tilsvarende ekstraktionseffektiviteter blev opnået mellem automatiserede QIAcube og manuel TruTip metoder ved 10 6 genkopier influenza A per ml nasopharyngealt aspirat. Formålet med denne undersøgelse var at påvise mellem-og high-throughput, automatiserede TruTip nukleinsyreoprensning procedurer for nasopharyngealt aspirat (NPA) og andre klinisk relevante prøvetyper, der anvender flydende håndtering robotter almindeligvis findes i reference-kliniske laboratorier.
Enkeltheden af TruTip koncept og workflow (figur 1) gør det let tilpasses, automatiseret og effektiv for en række kliniske prøvematricer, input prøvevolumener og flydende håndteringssystemer. Det bør imidlertid erkendes, at hver klinisk prøve er unik, og vil variere ene til den næste i viskositet, partikler, slim, overfladeforurening, mikrobielle og / eller humane genetiske baggrunde. Da forventede variationer i klinisk prøve sammensætning og planlagt anvendelse af en automatiseret TruTip prøveforberedelse protokol, kan det derfor være nødvendigt at ændre visse trin i en TruTip procedure for at opnå de ønskede resultater for en bestemt prøvetype. Uanset prøvetypen imidlertid TruTip parametre, der typisk har størst betydning for nukleinsyre renhed og / eller nyttiggørelse omfatter:
Fordi geometri, pipettespidsen materiale og fastgørelse metode til robot kanal arme er unikke for hvert instrument fabrikanten, en anden TruTip konstruktion kræves for hver væskehåndteringssystem. De TruTip monolit dimensioner (diameter, tykkelse og porestørrelse) ikke korrelerer med nukleinsyre bindende kapacitet (og eluering effektivitet), er som forventet for en fast-fase ekstraktion teknik. Mens tyk (> 4 mm) matricer kan være indlejret i en 1 ml TruTip at øge nukleinsyrebinding kapacitet til store mængder prøver og / eller udligne bindingskapaciteten tværs specifikke TruTip formater, der er en afvejning mellem TruTip tykkelse og strømningshastigheder under den indledende bindende trin (i nærvær af rå lysater). Således er det nogle gange en fordel at integrere større diameter bautasten i større volumen pipettespidser til de indledende trin i en automatiseret protokol (f.eks </ Em> de 5 ml Hamilton / Akonni TruTips for stor volumen ekstraktioner). I betragtning af de specifikke TruTip konfigurationer dikteret af producenterne af væskehåndteringssystemer robotter, men vi ikke nødvendigvis forvente TruTip nukleinsyre udbytter til at være ens på tværs væskehåndteringssystemer platforme fra forskellige producenter eller på tværs af forskellige TruTip størrelser.
Kliniske prøver (pr. definition) vil indeholde betydelige mængder af humant genomisk DNA, medmindre de er erhvervet fra normalt sterile steder (f.eks cerebral spinalvæske). Undertiden humant genomisk DNA ønskes (som i figur 6), mens det i andre applikationer menneskelige DNA repræsenterer en uønsket genomisk baggrund (som for figur 5). Tilstedeværelsen af baggrunds-DNA er normalt ikke problematisk, så længe den totale mængde af nukleinsyre i prøven ikke overstiger bindingskapacitet monolit, og baggrunden DNA kan tjene som en bærer, hvis den ønskede målnucleinsyrensyre er til stede i spormængder. Formålet med den højvolumen plasma udvinding protokol (fig. 7) er at isolere (fragmenteret) føtalt DNA i nærvær af en 10-20 fold overskud af moderens DNA, som svarer til prøveforberedelse målet af smitsomme sygdomme tests, bortset fra at sekvenserne er stærkt kongruent og kan kun skelnes ved meget specifik molekylær test og / eller størrelse diskrimination. I dette tilfælde er den samlede cirkulerende DNA isoleret ved hjælp af en 5 ml TruTip, og efterfølgende høj-molekylære og lavmolekylære føtal DNA separeres gennem efterfølgende binding og eluering til en 1 ml TruTip ved at ændre de bindingsbuffer betingelser. Selektiv størrelse adskillelse og berigelse af målnukleinsyrer baseret på deres binding og eluering egenskaber på en silica-monolit er et væsentligt anderledes virkningsmekanisme end opnået ved membraner eller gelpermeations spinsøjler. Størrelse adskillelse og berigelse af mikrobielt DNA fra humant genomisk DNA kan være enccomplished i fremtidige programmer via tilpasning TruTip bindende og elueringsbuffere.
Den automatiserede protokoller viste her understrege nytten af TruTip monolit selv til behandling forskellige kliniske prøver, og hvordan det kan tilpasses til store mængder og specifikke væskehåndteringssystemer robotter. De strømlinede metoder typisk resultere i hurtigere udvinding protokoller i forhold til andre automatiserede systemer. Enkeltheden i TruTip teknologi, men giver også nogle omkostningsfordele for dem interesseret i at købe en ny, automatiseret nukleinsyre rensning system, fordi den primære hardware, der kræves for at automatisere TruTip procedurer pipetten kanal arm snarere end magnetiske stænger, vakuum systemer eller om bord centrifuger. Udnytte fyldte reagensplader kan også reducere plads og krævede forbrugsvarer, og fordoble gennemløb per løb. Minimering dæksplads med TruTip protokoller gør det også muligt avancerede brugere til at integrere tidligere eller downstream automatiserede processer med TruTip. For eksempel Hamiltons easyBlood løsning på fraktionering fuldblod kan indarbejdes med det automatiserede TruTip ekstraktion metode, som medfører en væsentlig strømlining bio-banking-processer. Post-udvinding processer såsom nukleinsyre kvantificering, normalisering, PCR set-up, eller DNA-sekventering er også let integreres med TruTip de større væskehåndteringssystemer platforme.
The authors have nothing to disclose.
Dele af dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) under tilskud R 44 AI072784. Vi takker Dr. Kirsten St. George, Sara B. Griesemer, Daryl Lamson og Amy Dean af Laboratoriet for virussygdomme Wadsworth center, New York State Dept. of Health for kvantificerede influenza virioner og adgang til klinisk valideret influenza realtid PCR-assays.
Reagent/Material | |||
TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-11120 | |
95% Ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
99% Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-4L | |
DEPC-treated water | Life Technologies | AM9906 | |
Reagent Reservoir, 30 ml | Eppendorf | 960050100 | |
Deep well plate 96/2,000 μl | USA Scientific | 30502302 | |
epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl | Eppendorf | 960050100 | |
Equipment | |||
epMotion 5070 System | Eppendorf | 5070 000.000 | |
Dispensing tool TM1000-8 | 960001061 | ||
Reservoir rack | 960002148 | ||
Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-20341 | |
95% ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235905 | |
1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235904 | |
50 ml Reagent Trough | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
Deep Well 2 ml plate | USA Scientific | 1896-2800 | |
Nunc 96 DWP-2 ml | Thermofisher | 27874 | |
Reagent Trough | Fisher | 14-222-412 | |
Equipment | |||
Hamilton STAR System | Hamilton Robotics, Inc. | 173027 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173050 | |
1 ml 96-channel head | Hamilton Robotics, Inc. | 199090 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
Sample Carriers/Inserts | Hamilton Robotics, Inc. | 173400/182238 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
HHS2 Heater Shaker Unit | Hamilton Robotics, Inc. | 199033 | |
Rack Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | Call to inquire | |
100% ethanol | Sigma-Aldrich | 459828-1L | |
Isopropanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC327270010 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
Filtered 4 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 184022 | |
Unfiltered 1 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 235939 | |
96-Deep Well Plates | USA Scientific | 1896-2800 | |
50 ml Conical Tubes | Corning/ThermoFisher Scientific | 05-526B | |
50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
120 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 182703 | |
Large Volume 96-Pos Reagent Troughs | ThermoFisher Scientific | 14-222-412 | |
Equipment | |||
STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module | Hamilton Robotics, Inc. | 173025/190012 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173052 | |
5 ml Independent Channel / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 184090/173050 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
120 ml Reagent trough carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 185290 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
50 ml Tube Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182245 | |
24 Position Sample Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 173400 | |
32 Position Sample Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 173410 | |
Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma. |