Este protocolo se muestran dos métodos de inoculación para introducir el hongo entomopatógeno<em> Beauveria bassiana</em> Como endofito en el frijol común (<em> Phaseolus vulgaris</em>), Como preparación para las evaluaciones posteriores de control biológico endofítica.
Beauveria bassiana es un hongo entomopatógeno con la capacidad de colonizar plantas endofíticamente. Como B. endófito, bassiana puede jugar un papel en la protección de plantas de herbivoría y enfermedad. Este protocolo se muestran dos métodos de inoculación para establecer B. bassiana endofíticamente en el frijol común (Phaseolus vulgaris), en preparación para las evaluaciones posteriores de control biológico endofítica. Las plantas se cultivan a partir de semillas esterilizadas superficialmente durante dos semanas antes de recibir una B. tratamiento de bassiana 10 8 conidios / ml (o agua) aplicados como una pulverización foliar o tratamiento del suelo. Dos semanas más tarde, las plantas se cosecharon y sus hojas, tallos y raíces se muestrean para evaluar la colonización de hongos endofíticos. Para esto, las muestras son individualmente esterilizadas en superficie, se cortaron en secciones múltiples, y se incubaron en medios de agar de dextrosa de patata durante 20 días. Los medios de comunicación se inspecciona cada 2-3 días para observar el crecimiento de hongos comoasociado con partes de la instalación y registrar la ocurrencia de B. bassiana para estimar el alcance de su colonización endofítica. Los análisis de éxito inoculación comparar la ocurrencia de B. bassiana dentro de una parte de planta dada (es decir, hojas, tallos o raíces) a través de tratamientos y controles. Además del método de inoculación, el resultado específico del experimento puede depender de las especies de cultivo o variedad, las especies de hongos entomopatógenos cepa o aislado utilizada, y las condiciones de crecimiento de la planta.
Hongos entomopatógenos son importantes reguladores de las poblaciones de insectos con un potencial considerable como micopesticidas 1. Sólo recientemente, sin embargo, tienen hongos entomopatógenos han demostrado que se producen como endófitos, tanto de forma natural y en respuesta a los métodos de inoculación diferentes 2. La función ecológica de los hongos entomopatógenos endofíticos sigue siendo en gran parte desconocida, pero algunos estudios han implicado en el crecimiento de las plantas 3,4, la resistencia herbívoro 5-8, y la resistencia a la enfermedad 9,10. El objetivo general de los métodos presentados aquí es la introducción de un hongo entomopatógeno como endofito, en preparación para las evaluaciones posteriores de control biológico endofítica.
Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) es el mejor estudiado hongos endofíticos entomopatógeno 5-9,11-19, y está disponible como una mycopesticide comercial. Inoculación probado a establecer <em> B. bassiana como endofito incluyen pociones suelos, revestimientos de semillas 14,17 18 y 14 inmersiones, salsas 13,15 radícula, raíz y rizoma inmersiones 11,16,18, tallo inyecciones de 17 de pulverizaciones foliares 14,17,20 y sprays de flores 19. Utilizando estos métodos, los investigadores han introducido B. bassiana en 11 plátano, frijol 7, 13 cacao, café 17, 7 de maíz, algodón 7, palmera datilera 12 de yute 21 de adormidera 20, calabaza 7, pino radiata 18, sorgo 14, tomate y trigo 7 7. La evidencia reciente sugiere que endofítica B. bassiana tiene el potencial de proteger a las plantas no sólo de las plagas de artrópodos 5-7,22-27, sino también de algunos patógenos de plantas 9.
El frijol común (Phaseolus vulgaris) se encuentra entre los cultivos más vulnerables a las plagasplagas y enfermedades. Puede ser afectado por más de 400 plagas y patógenos 200, cuyo ataque se cree que es el factor más limitante bean producción entre las regiones 28. En consecuencia, la alubia común puede ser un modelo de cultivo excelente para examinar todo el espectro de control biológico endofítica por B. bassiana. Como primer paso en esta dirección, este artículo describe aplicaciones foliares y de suelo pociones como métodos de inoculación para introducir B.bassiana como endofito en el frijol común.
Hay muchos factores que pueden influir en el resultado específico de un experimento para establecer un hongo entomopatógeno como endofito. Nuestros resultados demuestran el método de inoculación es una de ellas. Los factores biológicos incluyen a experimentar con el cultivo de especies o cultivares seleccionados y la cepa del hongo entomopatógeno especies o aislar utilizado. Otros factores a considerar incluyen la manipulación de la concentración del inóculo, la edad de la planta durante inoculaciones, y las condiciones de crecimiento de la planta.
Sería ideal para un método de inoculación para dar lugar a la colonización planta sistémica por un entomopatógeno 14,17,18,21 hongos. En cambio, parece que los métodos de inoculación tienden a favorecer un patrón específico de colonización local. En el café, por ejemplo, pulverizaciones foliares favorecer la colonización hoja mientras que empapa el suelo favorece colonización de la raíz 17. Encontramos el mismo patrón en el frijol común. En última instancia, la elección del método de inoculación debe serguiada por la ubicación prevista de la endofito dentro de una planta, es de suponer que coincida con el lugar de destino o el herbívoro patógeno de la planta.
Aunque comúnmente utilizado, la detección y cuantificación endofito basa en culturas mediáticas puede ser costoso, difícil y propenso a errores. Por ejemplo, un total de 10.800 secciones de la planta (1.800 sembraron en placas de Petri) se evaluaron en un experimento para optimizar B. bassiana inoculaciones de plátano 16. De estos, 4.496 secciones fueron colonizados por un putativo B. bassiana, como se identifica principalmente por la morfología de colonia. Es evidente que una verificación microscópica de la especie para cada colonia habría sido un paso deseable, pero inalcanzable. Por otra parte, 1.176 secciones fueron colonizadas por otros hongos y se descartaron y se trata como datos que faltan 16. La probabilidad existe, sin embargo, que B. bassiana es un mal competidor o más lento para crecer, y eventualmente podría haber surgido de esas secciones si untiempo suficiente llowed. Por lo tanto, los métodos de detección basados en endófitos culturas mediáticas están sujetos a los falsos positivos y falsos negativos. En consecuencia, el desarrollo de una detección más fiable y cuantificación métodos, por ejemplo los basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 20,21,24, está bien justificada.
El objetivo final de los experimentos de inoculación debe ser el desarrollo de un tratamiento eficaz que proporciona una resistencia sistémica duradera contra la herbivoría y / o enfermedad. Una plausible, pero como aún no probado, la hipótesis es que el alcance de la colonización endofítica debe correlacionarse positivamente con el grado de endófito resistencia mediada. Un paso natural después de refinar los métodos de inoculación, por lo tanto, podría ser examinar esta correlación. Varios protocolos de vídeo puede ayudar a los investigadores a diseñar un ensayo de resistencia adecuada para una plaga o patógeno 29-31. En última instancia, este ensayo es lo que determina el éxito de la inoculaciónmétodo ción, y el potencial para el control biológico asociado endofítica.
The authors have nothing to disclose.
La producción y el trabajo experimental presentado en este documento reflejan la ayuda dedicada y entusiasta de Reynaldo Pareja. Financiado por el Departamento Administrativo de Colombia de Ciencia, Tecnología e Innovación (Colciencias) y por una donación de la Fundación Bill & Melinda Gates Foundation a través de la iniciativa Grand Challenges Exploraciones.
REAGENTS | |||
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
Mycotrol SE | Laverlam | 4167 | |
Noble agar | Sigma | A5431-250G | |
Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-25MU | |
Petri dish (100 x 15 mm) | Fisher | 08-757-12 | |
Petri dish (60 x 15 mm) | Fisher | 08-757-13A | |
Potato dextrose agar | Difco | 213400 | |
Regular bleach (NaOCl) | CLOROX | N/A | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
Tetracycline | Sigma | T3258-25G | |
Triple quince (NPK) | ABOCOL | N/A | |
Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
EQUIPMENT | |||
Biological safety cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
Leica DM LB microscope | Leica | N/A |