Coculture Analys av extracellulärt protein interaktioner som kan påverka insulinutsöndringen från betacellerna i bukspottkörteln
Summary
Transcellulär proteinväxelverkningar är viktiga faktorer för bukspottkörtel betacellfunktion. Detaljerad här är en metod anpassad från en samodling modell synaptogenesis-för att undersöka hur specifika transmembranproteiner påverkar insulinutsöndring. Transfekterade HEK293-celler uttrycka proteiner av intresse, beta celler behöver inte skall transfekteras eller på annat sätt direkt perturbed.
Abstract
Interaktioner mellan cellytproteiner hjälpa till att samordna funktionen av angränsande celler. Betaceller är grupperade tillsammans inom pankreascellöar och agera på ett samordnat sätt för att upprätthålla glukoshomeostas. Det blir alltmer tydligt att samspelet mellan transmembranproteiner på ytorna av intilliggande betaceller är viktiga faktorer för beta-cellernas funktion.
Klarläggande av rollerna av särskilda transcellulär interaktioner från knockdown, knockout eller överuttryck studier i odlade betaceller eller in vivo kräver direkt störning av mRNA och protein expression, potentiellt påverka beta-cell hälsa och / eller funktion på ett sätt som kunde förbrylla analyser av effekterna av specifika interaktioner. Dessa tillvägagångssätt också förändra nivåerna av de intracellulära domänerna av de riktade proteinerna och kan förhindra effekter på grund av interaktionen mellan proteiner inom samma cell membran skall kopplas bortpräglats från effekterna av transcellulär interaktioner.
Här är en metod för att bestämma effekten av specifika transcellulär interaktioner på insulinproducerande kapacitet och lyhördhet betaceller presenteras. Denna metod är tillämplig på beta-cellinjer, såsom INS-1-celler, och dissocierade primära betaceller. Den är baserad på samodling modeller som utvecklats av neurobiologists, som fann att exponering av odlade nervceller till specifika neuronala proteiner som uttrycks på HEK293 (eller COS) cellager identifierade proteiner som är viktiga för att driva synapsebildande. Med tanke på parallellerna mellan den sekretoriska maskineriet av neuronala synapser och betaceller, motiverade vi att beta-cell funktionell mognad kan drivas av liknande transcellulär interaktioner. Vi utvecklade ett system där betaceller odlas på ett skikt av HEK293-celler som uttrycker ett protein av intresse. I denna modell är den beta-cellens cytoplasma orörd medan extracellulärt protein-protein interactions manipuleras. Även om vi fokuserar här främst på studier av glukos-stimulerad insulinsekretion, kan andra processer analyseras, till exempel, som förändringar i genuttryck bestäms genom immunoblottning eller qPCR.
Introduction
Vi beskriver här en metod för att underlätta undersökningar av hur de extracellulära domänerna av specifika transmembranproteiner påverkar insulinsekretionen. Metoden sonder effekterna av interaktion mellan proteinet av intresse med proteiner (eller eventuellt andra molekyler) på pankreatisk beta-cellytan. Metoden möjliggör undersökningar av hur cellytproteiner uttrycks av betaceller eller av andra närliggande celler (t.ex. endotelceller, neuroner, pankreas alfaceller) påverkar betacellfunktionen genom transcellulär interaktioner (dvs. genom interaktioner med interaktionspartner på ytan av intilliggande betaceller).
Den cellulära plasmamembran innehåller en komplex samling av strukturella och funktionella proteiner som fungerar som broar till den extracellulära miljön. Genom bildandet av transcellulär anslutningar eller genom initiering av plast signalering händelser, kan interaktioner mellan cellytproteiner hjälpa till att samordnafunktion av angränsande celler. Betaceller är grupperade tillsammans inom pankreasöarna och agera på ett samordnat sätt för att upprätthålla glukoshomeostas 1. Som visat, exempelvis genom vikten av extracellulära EPHA-ephrinA och neuroligin-2 interaktioner i regleringen av glukos-stimulerad insulinsekretion, blir det allt mer tydligt att ökad kunskap om de extracellulära interaktioner som förekommer mellan proteiner på ytan av intilliggande betaceller kommer att vara av stor betydelse för att få en full förståelse av insulinutsöndring, beta cell funktionell mognad och underhåll av glukoshomeostasen 1-3. Målet med den här beskrivna metoden är att möjliggöra undersökningar av effekterna på betacellsfunktionen av transcellulär interaktioner med specifika trans eller annat-cell-ytan-associerade proteiner. Genom samodling betaceller med HEK293 celler transfekterade med olika uttryckskonstruktioner, effekterna på beta cellernas funktion av olika proteiner på cellernas ytor eller muterade varianter därav kan vara effektivt sonderade. Detta åstadkommes utan att behöva transfektera betacellerna själva.
Klarläggande av rollerna av särskilda transcellulär interaktioner från knockdown, knockout eller överuttryck studier i odlade betaceller eller in vivo kräver direkt störning av beta-cellens mRNA och protein expression, potentiellt påverka beta cell hälsa och / eller funktion på ett sätt som kunde förbrylla analyser av effekterna av specifika extracellulära interaktioner. Dessa angreppssätt också förändra nivåerna av de intracellulära domänerna av de riktade proteiner och vidare inte tillåter effekter på grund av interaktioner mellan proteiner på eller i samma cell som ska särskiljas från effekterna av transcellulär interaktioner. Här är en metod för att bestämma effekten av specifika transcellulär interaktioner på insulinproducerande kapacitet och lyhördhet av betaceller described. Denna metod är tillämplig på insulinproducerande beta-cellinjer, såsom INS-1-celler 4, och dissocierade primära gnagare eller humana beta. Den är baserad på samodling modeller som utvecklats av neurobiologists, som fann att exponering av odlade nervceller till specifika neuronala proteiner som uttrycks på HEK293 (eller COS) cellager kunde identifiera proteiner som kör synapsebildande 5,6. Med tanke på parallellerna mellan den sekretoriska maskineriet av neuronala synapser och betaceller, motiverade vi att betacellfunktionen och funktionell mognad kan drivas av liknande transcellulär interaktioner 7-9. För att undersöka dessa interaktioner, utvecklade vi det här beskrivna systemet i vilket betaceller samodlades på ett lager av HEK293-celler som uttrycker ett protein av intresse 10. Detta system gör det beta-cellens cytoplasma att förbli orörda medan extracellulära protein-protein-interaktioner är manipulerade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den coculture här beskrivna metoden ger ett effektivt sätt att bestämma den fysiologiska betydelsen av specifika beta-cell-ytan, transmembranproteiner, och specifikt om deras extracellulära domäner. Genom odling av beta eller celler insulinomceller (såsom INS-1 celler som används här) i kontakt med HEK293 celler som uppvisar ett intressant protein på cellytan, kan experiment utformas för att bestämma effekterna av extracellulära protein-protein-interaktioner utan att direkt störa den intracellulära miljön…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag R01DK080971 och Juvenile Diabetes Research Foundation 37-2009-44. Vi uppskattar även stödet från UCSD Pediatric Diabetes Research Center (PDRC).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| pcDNA 3.3 vector/backbone | Invitrogen | K830001 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 18324012 | |
| DMEM | Mediatech | 45001-312 | |
| Pen/strep solution | Mediatech | 45001-652-1 | |
| Amphotericin B | Mediatech | 45001-808-1/30 | |
| RPMI-1640 | Mediatech | 45001-404 | |
| D-PBS | Mediatech | 45001-434 | |
| Sodium Pyruvate | Mediatech | 45001-710-1 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Cell stripper | Mediatech | 45000-668 | |
| T75 Flask | BD | 1368065 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| 10X PBS | Mediatech | 45001-130 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech | MT35010CV | |
| IBMX | Sigma | I5879-100MG | |
| RIPA lysis buffer | Sigma | R0278 |
References
- Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129, 359-370 (2007).
- Jain, R., Lammert, E. Cell-cell interactions in the endocrine pancreas. Diabetes Obes. Metab. 11, 159-167 (2009).
- Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).
- Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. How to build a central synapse: clues from cell culture. Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).
- Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell. 101, 657-669 (2000).
- Abderrahmani, A., et al. Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion. FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).
- Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common. The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).
- Suckow, A. T., et al. Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion. Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).
- Suckow, A. T., et al. Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function. The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).
- Kohnert, K. D., Hehmke, B. Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods. J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125 (2009).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets. J. Vis. Exp. (27), e1343 (2009).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
- Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets. Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).
- Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads. Diabetes. 31, 189-193 (1982).
- Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10, 9 (2010).
