Photothrombotic Ischemia: en minimalinvasiv och reproducerbar fotokemisk Kortikal lesion modell för studier Mouse Stroke

Summary

Photothrombosis är en snabb, minimalinvasiv teknik för att framkalla små och väl avgränsade infarkt inom områden av intresse för högt reproducerbart sätt. Det är särskilt lämplig för att studera cellulära och molekylära reaktioner som ligger bakom hjärnans plasticitet i transgena möss.

Abstract

Den photothrombotic stroke Modellen syftar till att inducera en ischemisk skada inom ett givet kortikala område med hjälp av foto-aktivering av en tidigare injicerat ljuskänslig färg. Efter belysningen, är färgen aktiveras och producerar singlettsyre som skadar komponenter i endotelceller cellmembran, med efterföljande trombocytaggregation och blodproppar bildas, vilket slutligen avgör avbrott i lokalt blodflöde. Detta tillvägagångssätt, som ursprungligen föreslogs av Rosenblum och El-Sabban 1977, blev senare förbättrades med Watson i 1985 i råtta hjärnan och ange grunden för den nuvarande modellen. Dessutom bidrog den ökade tillgängligheten av transgena mus linjer vidare att höja räntan på photothrombosis modellen. Kortfattat är en fotokänslig färgämne (Rose Bengal) injiceras intraperitonealt och kommer in i blodströmmen. När belyses av en kall ljuskälla, blir färgämnet aktiveras och inducerar endotelskada med trombocytaktivering och trombos, vilket resulterar i lokalblodflödet avbrott. Ljuskällan kan appliceras på intakt skallen med något behov av kraniotomi, vilket möjliggör målsökning av alla kortikala område av intresse på ett reproducerbart och icke-invasivt sätt. Musen sutureras sedan och tilläts vakna upp. Utvärderingen av ischemisk skada kan snabbt utföras av trifenyl-tetrazoliumklorid eller kresylviolett färgning. Denna teknik producerar infarkt av ringa storlek och väl avgränsade gränser, vilket är mycket fördelaktigt för exakt cell karakterisering eller funktionella studier. Vidare är den speciellt lämplig för att studera cellulära och molekylära reaktioner som ligger bakom hjärnans plasticitet i transgena möss.

Introduction

I början av det 21th århundradet, är ischemisk stroke en förödande sjukdom som representerar den näst största orsaken till långvarig funktionsnedsättning ¹ och den näst största orsaken till dödlighet i hela världen, där stroke stod för cirka 5,7 miljoner dödsfall under 2004 ^2. Trots de många insatser som sattes in, det finns fortfarande ingen effektiv behandling tillgänglig för att förbättra funktionell återhämtning efter stroke. Djurmodeller av stroke används allmänt inom området för stroke forskning som de tillåter modellering av patofysiologin för ischemisk skada och testa effektiviteten hos olika nervskyddande strategier in vivo. De flesta av dessa modeller syftar till att inducera omfattande infarkt genom att avbryta (temporärt eller permanent) den blodflödet i mitten cerebral artär, medan andra modeller har utvecklats för att studera skador av liten storlek på särskilda områden, typiskt motorn och somatosensoriska cortex. Emellertid kan ett flertal faktorer bidrar till generera acissa grad av variabilitet i experimentella stroke studier, inklusive musen används stam, ålder och kön som ingår i studien, och, framför allt, antog teknik för att inducera ischemiska skador. När det gäller den sistnämnda punkten, varaktigheten och invasiv kirurgi (dvs. behovet av en kraniotomi) samt kirurgisk skicklighet krävs för operatören att tillförlitligt inducera en ischemisk lesion har en avgörande betydelse för en framgångsrik och opartisk in vivo stroke studie .

Begreppet photothrombosis ursprungligen föreslagits av Rosenblum och El-Sabban 1977 ³ och blev känd genom sin ansökan i råtthjärnan av Watson et al 1985 ⁴ där tekniken har förbättrats avsevärt och lägga grunden för den nuvarande modellen ^{3. – 6.} Den photothrombotic tillvägagångssätt syftar till att inducera en kortikal infarkt genom foto-aktivering av ett ljuskänsligt färgämne tidigare levererat i blodsystemet, WHich resulterar i lokal kärl trombos i områden som exponeras för ljus. När den cirkulerande färgämnet är upplyst på den lämpliga våglängden av en kall ljuskälla, frigörs energi till syremolekyler som i sin tur genererar en stor mängd mycket reaktiva produkter singlettsyre. Dessa syreintermediärer framkalla endothelial peroxidation cellmembranet, vilket leder till trombocytvidhäftning och aggregering, och så småningom till bildandet av tromber som bestämmer lokal cerebral flöde avbrott ^7.

Photothrombosis är en icke-kanonisk ischemisk modell som inte täpper eller bryta bara en artär som det oftast sker i människans stroke, men framkallar lesioner i mer ytliga kärl, vilket resulterar i selektiv avbrott av blodflödet i de områden som utsätts för ljus. Av denna anledning, kan detta tillvägagångssätt vara lämpligt för cellulära och molekylära studier av kortikal plasticitet. Den huvudsakliga fördelen med denna teknik ligger i dess enkelhet i utförande.Dessutom kan photothrombosis lätt utföras i ungefär fyrtio minuter per djur, inklusive tjugo minuters väntan (3 min för anestesi, 1 min att raka hårbotten, 3 till 5 minuter att placera djuret på stereotaxic apparater, 2 min att skrubba hårbotten med antiseptisk lösning, gör ett snitt och rensa skallen, 2 till 4 min för att placera det kalla ljuset fiber, 1 min för att injicera Rose Bengal-lösning, 5 min-vänta för intraperitoneal diffusion, 15 min av belysning, och 5 min till rengöra såret och sutur djuret). Dessutom är ingen kirurgisk expertis som krävs för att utföra denna teknik som lesionen induceras genom enkel belysning av skallbenet. Till skillnad från klassisk arteriell ocklusion, bestämmer denna metod selektiva inneslutningar av pial och intraparenkymal mikrokärl inom det bestrålade området och minskar variationsrikedomen bland lesioner som ingen säkerhet fartyget är kvar att leverera syre i målområdet.

Trots dess speciella karaktär, denphotothrombotic skador aktier viktiga mekanismer som sker i hjärnan stroke. På liknande sätt som artärocklusion i human stroke, trombocytaggregation och koagelbildning bestämmer avbrott i blodflödet i det bestrålade området ^7. Likaså delar denna modell också viktiga inflammatoriska svar som i mellersta cerebral artär ocklusion ^8. Men på grund av de väl avgränsas avgränsningar är halvskugga zonen, vilket motsvarar ett område med delvis bevarad metabolism, mycket reducerad eller obefintlig efter en photothrombotic lesion. Denna tydliga gräns kan underlätta studier av cellulära svar inom ischemisk eller intakt kortikal area. Photothrombosis musmodell är särskilt lämplig för stroke studier i en mängd av transgena djur. Faktum klassiska modeller inte kan passa alla stammar och långa studier period i C57BL / 6 musstam rapporterade en hög dödlighet förhållande som kan orsaka partiskhet ^9.

Protocol

Ett. Pre-operation Väg Rose Bengal i ett 1,5 ml rör och lös upp i steril saltlösning tills den når en slutlig koncentration av 15 mg / ml. Filtrera sterilisera genom ett 0,2 ìm filter och förvara den i mörker vid rumstemperatur upp till två månader. Sterilisera alla kirurgiska instrument genom autoklavering. Den kirurgiska området bör saneras mindre än en timme före initiering av operationen. Notera vikten mushöljet att justera dosen av Rose Bengal som ska injiceras. Vi inji…

Representative Results

Detta protokoll kommer att producera en kortikal lesion som är redan synlig vid dissektion av hjärnbarken för blotta ögat (fig. 1A-1C). Den photothrombotic lesion utvecklas i ytliga och djupa kortikala skikt i vilka vävnaden är tillräckligt genomskinlig för att medge foto-aktivering av Rose Bengal. Mätning av omfattningen av hjärninfarkt kan utföras snabbt genom histologisk färgning med trifenyl-tetrazoliumklorid (TTC) på färsk vävnad eller genom kresylviolett efter fixering i 4% paraform…

Discussion

Modifikationer och substitutioner

På grund av dess absorption topp vid 562 nm, var ett grönt ljus laser från en filtrerad xenonbåglampa ursprungligen valt att bestråla den ljuskänsliga Rose Bengal. Även laser-medierad excitation användes fortfarande recently5, kan det ersättas av kallt ljus lampa som också säkerställa färgämne excitation ^10,15. Kallt ljus optiska fibrer är lättare att manipulera och billigare än laser källor. Emellertid bör det noteras att lasrar v…

Materials

MATERIAL NAME	COMPANY	CATALOGUE NUMBER
			Solutions and chemicals
Rose Bengal	Sigma, Italy	330000
Isoflurane Vet	Merial	103120022
Betadine	Asta Medica
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
			Surgical material and equipment
Fluosorber Filter	Havard apparatus	340415
150W fiber optic illuminator	Photonic	PL3000
Temperature Controller for Plate TCAT-2DF	Havard apparatus	727561
Stereotaxic Instrument	Stoelting	51950
Operating microscope	Takagi	OM8
Heating pad
Oxygen and nitrogen gas
Surgery Tools	World precision instrument		Optic fiber taps and mask are custom-made