पत्रिका का उपयोग मानव रेटिना सर्जिकल नमूने के transcriptomic विश्लेषण
Summary
हम रेटिना टुकड़ी के एक transcriptomic विश्लेषण के लिए retinectomy से रेटिना नमूनों का इस्तेमाल किया. हम सर्जिकल ब्लॉक और प्रयोगशाला के बीच शाही सेना के संरक्षण की अनुमति देता है कि एक प्रक्रिया विकसित की है. हम शुद्ध RNAs के माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं विश्वास दिलाता हूं कि सीज़ियम क्लोराइड ultracentrifugation द्वारा शाही सेना को शुद्ध करने के लिए मानकीकृत एक प्रोटोकॉल.
Abstract
रेटिना टुकड़ी (आरडी) रेटिना वर्णक उपकला (RPE) से neurosensory रेटिना के एक जुदाई का वर्णन करता है. RPE के प्रकाश के प्रति संवेदनशील न्यूरॉन्स, photoreceptors के सामान्य कार्य के लिए आवश्यक है. RPE से रेटिना की टुकड़ी बाह्य तरल पदार्थ से भरा है कि एक भौतिक अंतर पैदा. आरडी neurosensory रेटिना और आयनों और मेटाबोलाइट्स के शारीरिक विनिमय गंभीर रूप से परेशान कर रहा है के बाद से RPE दोनों को प्रभावित करती है कि सेलुलर और आणविक प्रतिकूल घटनाओं आरंभ करता है. दर्शन के लिए परिणाम दृष्टि 1 की बहाली में दो ऊतकों परिणामों की एक तेजी से reapposition के बाद से सेना की टुकड़ी की अवधि से संबंधित है. आरडी के इलाज के लिए विशेष रूप से शल्य चिकित्सा है. कांच का जेल (vitrectomy) को हटाने के रेटिना टुकड़ी के पक्ष में अलग क्षेत्र के आसपास रेटिना को हटाने गैर अनिवार्य हिस्सा द्वारा पीछा किया जाता है. हटा रेटिना नमूनों को छोड़कर nullius (कुछ नहीं) कर रहे हैं और इसके परिणामस्वरूप सामान्य रूप से खारिज कर दिया.इन शल्य नमूनों से शाही सेना को ठीक करने के लिए, हम प्रयोगशाला के लिए शल्य ब्लॉक से स्थानांतरण के दौरान शाही सेना के संरक्षण की अनुमति देता है कि प्रक्रिया पत्रिका का विकास किया. हम भी सीज़ियम क्लोराइड ultracentrifugation द्वारा शाही सेना को शुद्ध करने के लिए मानकीकृत एक प्रोटोकॉल शुद्ध RNAs के वैश्विक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं कि विश्वास दिलाता हूं. शाही सेना की गुणवत्ता दोनों RT-पीसीआर और माइक्रोएरे विश्लेषण द्वारा मान्य किया गया था. आंकड़ों के विश्लेषण से आरडी के दौरान सूजन और फोटोरिसेप्टर अध: पतन का एक साथ भागीदारी से पता चलता है.
Introduction
रेटिना टुकड़ी में मुख्य चिकित्सीय उद्देश्य (आरडी) रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं से photoreceptors के अलग होने से उत्पन्न फोटोरिसेप्टर कोशिका क्षति और रेटिना सूजन सीमित करने के लिए एक रास्ता खोजने के लिए है. आरडी के दौरान, RPE कोशिकाओं dedifferentiate, विस्थापित, सक्रिय कर रहे हैं, और जटिलताओं के लिए अग्रणी सिकुड़ा बलों exerting, अलग रेटिना की सतह पर पैदा करना. आरडी की Transcriptomics विश्लेषण आरडी और शल्य चिकित्सा के साथ संयोजन में अंतिम दृश्य परिणाम में सुधार सकता है इसलिए भविष्य चिकित्सकीय अणुओं का पालन संशोधित अभिव्यक्ति के साथ लक्ष्य जीन की पहचान करने के लिए एक रास्ता है. यह अच्छी तरह से deoxyribonucleic एसिड (डीएनए) के रूप में ribonucleic एसिड (आरएनए) स्थिर नहीं है जाना जाता है, आनुवंशिक अध्ययन के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया जा रहा है उत्तरार्द्ध, इसकी स्थिरता 2 पुराने 30,000 से अधिक वर्षों के paleontological नमूनों से निएंडरथल जीनोम का अनुक्रमण की अनुमति दी थी. दूत शाही सेना में जीनोम से जीन के डीएनए के प्रतिलेखन हैप्रमुख जीन अभिव्यक्ति में प्रक्रिया, और mRNA एक संकेत का गठन करने के क्रम में अस्थिर है. RNAs के संकेत समाप्त जो RNAse एंजाइमों से बहुत तेजी से अपमानित कर रहे हैं. अभिव्यक्ति एक अनुसंधान प्रयोगशाला में अध्ययन किया है पहले ऊतकों एक जीव से अलग कर रहे हैं, RNAs बहुत बार अपमानित कर रहे हैं. अपमानित शाही सेना विश्लेषण जीन अभिव्यक्ति के लिए अनुकूल नहीं है. प्रयोगशाला स्टाफ सर्जरी में भाग नहीं ले सकते, क्योंकि हम आसान है कि एक प्रक्रिया विकसित की है और केवल सर्जन एक उपयुक्त RNase मुक्त समाधान में ऊतकों को ठीक करने की आवश्यकता है. ऊतकों की शाही सेना स्थिर है और इस समाधान में कमरे के तापमान पर 72 घंटे के बाद गिरावट के किसी भी हस्ताक्षर के बिना विश्लेषण किया जा सकता है. नमूनों से RNAs प्रयोगशाला 3 के लिए हस्तांतरित किया गया है के बाद एक सीज़ियम क्लोराइड ढाल पर एक ultracentrifugation शामिल मानकीकृत विधि द्वारा शुद्ध कर रहे हैं. फिर, RNAs के गुणवत्ता agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा और RT-पीसीआर द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं. शाही सेना शुद्धि प्रोटोकॉल हैडीएनए और आरएनए के लिए अलग है और आरएनए जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन में artifactual संकेतों उत्पन्न होगा एक डीएनए अणु से दूषित नहीं है कि भरोसा दिलाते हैं कि उनके घनत्व के अनुसार अणुओं को अलग करने का लाभ. इसके अलावा, मात्रात्मक एक कोशिका के भीतर सबसे प्रचुर मात्रा में आरएनए हैं जो हस्तांतरण RNAs (tRNAs), ribosomal शाही सेना (rRNAs) और दूत RNAs (mRNAs), किया जा रहा है उन दो पिछले एक से एक ही भौतिक संपत्ति के हिसाब से अलग हो रहे हैं शुद्धिकरण की प्रक्रिया के उत्पाद अंत. माइक्रोएरे विश्लेषणात्मक प्रोटोकॉल का सबसे tRNA 4-6 से हिचकते हैं जो रिवर्स transcriptases और आरएनए पीसीआर के उपयोग शामिल है के बाद से तैयारी से tRNA के हटाने उपयोगी है. शल्य नमूनों से शुद्ध आरएनए मानक प्रोटोकॉल का उपयोग लेबल और एक माइक्रोएरे चिप को संकरित और परिणाम पूरक दो तरीकों, झूठे खोज दर पद्धति का उपयोग कर, और आपसी जानकारी और visuali पर आधारित एक उपन्यास विधि का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैंवेब आधारित सर्वर Retinobase 7,8 पर जेड.
Protocol
Representative Results
Discussion
सर्जिकल ब्लॉक से ऊतक वसूली के लिए एक प्रक्रिया का विकास रेटिना टुकड़ी के transcriptome विश्लेषण करने के लिए आवश्यक हो गया है. एक सर्जरी के इस प्रकार की आपात स्थिति में और नेत्र रोग विज्ञानियों ऑपरेटिंग वे काम ज?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम शाही सेना शुद्धि प्रोटोकॉल संपादन में उनकी मदद के लिए सच्चा Reichman और डोमिनिक Santiard-दिग्गज धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Aventi J-E | |
| Rotor | Beckman Coulter | JS-5.3 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | LE 80K | |
| Rotor | Beckman Coulter | SW41 | |
| Power supply | Biorad | Pac 3000 | |
| PolytronTM | Kinematica | PT 2100 | Supplied with PT-DA 2105:2 |
| Agarose gel electrophoresis device | Biorad | MiniGel Cell GT | |
| Imaging System | Biorad | GelDoc-It Imager | |
| 5 ml sterile polyethylene tube | Greiner | 115261 | |
| Sterile polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| Chemical reagents | Sigma | Molecular biology grade (RNase and DNase free products) | |
| Cleaning Solution | VWR | RBS | |
| Microarray chip | Affymetrix | Human U133 plus 2 array |
References
- Mitry, D., Charteris, D. G., et al. The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations. The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678 (2010).
- Green, R. E., Krause, J., et al. A draft sequence of the Neandertal genome. Science. 328 (5979), 710 (2010).
- Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation. Biochemistry. 13 (12), 2633 (1974).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663 (1990).
- Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro. Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315 (1975).
- Sawadogo, M. On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin. Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261 (1981).
- Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death. PloS ONE. 6 (12), e28791 (2011).
- Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina. BMC Genomics. 9, 208 (2008).
- Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425 (2007).
- Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16 (2010).
- Chalmel, F., Leveillard, T., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).
