Transcriptomic Analysis of Human Retinal Kirurgiske Prøver Bruke Journal
Summary
Vi brukte retinal prøver fra retinectomy for en transcriptomic analyse av netthinneavløsning. Vi har utviklet en fremgangsmåte som tillater RNA bevaring mellom de kirurgiske blokker og laboratoriet. Vi standardisert en protokoll for å rense RNA ved cesiumklorid-ultrasentrifugering for å sikre at de rensede RNA er egnet for mikroarray-analyse.
Abstract
Netthinneavløsning (RD) beskriver en separasjon av nevrosensorisk netthinnen fra retinal pigmentert epitel (RPE). RPE er viktig for normal funksjon av de lysfølsomme nerveceller, fotoreseptorene. Avløsning av netthinnen fra RPE skaper en fysisk gap som er fylt med ekstracellulær væske. RD initierer cellulære og molekylære uønskede hendelser som påvirker både nevrosensorisk netthinnen og RPE siden den fysiologiske utveksling av ioner og metabolitter er sterkt opprørt. Konsekvensen for syn er knyttet til varigheten av løsgjøring da rask reapposition av de to vev resulterer i gjenopprettelse av syn 1.. Behandlingen av RD er utelukkende kirurgisk. Fjerning av glasslegemet gel (vitrektomi) etterfølges av fjerning av ikke essensiell del av netthinnen rundt det frittliggende område for å favorisere netthinneavløsning. De fjernede netthinnens eksemplarer er res nullius (ingenting) og følgelig normalt forkastet.For å gjenopprette RNA fra disse kirurgiske prøver, har vi utviklet prosedyren tidsskrift som gjør at RNA bevaring under overføringen fra kirurgisk blokk til laboratoriet. Vi har også en standardisert protokoll for å rense RNA ved cesiumklorid-ultrasentrifugering for å sikre at de rensede RNA er egnet for global genekspresjon analyse. Kvaliteten av RNA ble validert både med RT-PCR-analyse og mikromatrise. Analyse av data viser en samtidig involvering av betennelse og fotoreseptor degenerasjon under RD.
Introduction
Den viktigste terapeutiske målet i netthinneavløsning (RD) er å finne en måte å begrense fotoreseptoren celleskader og retinal betennelse som resulterer fra separeringen av de fra de retinale fotoreseptorer pigmenterte epitel-celler. Under RD, er RPE celler aktiveres, migrere dedifferentiate, og sprer på overflaten av frittliggende netthinnen, øve kontraktile krefter som fører til komplikasjoner. Transcriptomics analyse av RD er en måte å identifisere målgener med modifisert uttrykket etter RD og dermed fremtidige terapeutiske molekyler som kan forbedre endelige visuelle resultatet i kombinasjon med kirurgi. Det er velkjent ribonukleinsyre (RNA) ikke er stabilt som er deoksyribonukleinsyre (DNA), idet sistnevnte er i utstrakt bruk for genetiske studier, eventuelt at stabiliteten tillates sekvensering av Neanderthal genomet fra paleontological prøver av mer enn 30.000 år 2.. Transkripsjon av DNA av genene fra genomet til messenger RNA er detstor prosess i genekspresjon, og det mRNA som er labil for å utgjøre et signal. RNA er meget hurtig degradert av RNAse-enzymer som avsluttes signalet. Når vev er isolert fra en organisme, de RNA er svært ofte degradert før uttrykket er studert i et forskningslaboratorium. Degradert RNA er ikke egnet for analyse av genuttrykk. Fordi laboratoriet ansatte ikke kan delta i operasjonen, har vi utviklet en prosedyre som er enkel og krever bare at kirurgen å gjenopprette vev i en egnet RNAse løsning. RNA av vevet er stabil og kan analyseres uten noen tegn på nedbrytning etter 72 timer ved romtemperatur og i denne løsningen. The RNAs fra prøver blir renset ved en standardisert metode som involverer en ultrasentrifugering på en cesiumklorid gradient etter å ha blitt overført til laboratoriet 3.. Deretter blir kvaliteten av RNAer vurdert ved agarose-gelelektroforese og ved RT-PCR. RNA rensing protokollen harFordelen med å separere molekyler i henhold til deres tetthet som er forskjellig for DNA og RNA, og sikrer at RNA ikke blir forurenset med DNA-molekyler som vil generere artifactual signaler i genekspresjon studier. I tillegg er transfer RNA (tRNA), som er de mest tallrike kvantitativt RNA i en celle, og er adskilt i henhold til den samme fysiske egenskapen fra det ribosomale RNA (rRNAs) og messenger RNA (mRNA), de to siste er den Sluttproduktet av renseprosessen. Fjerningen av tRNA fra preparatet er nyttig siden det meste av mikromatriser analytiske protokoller involverte bruk av omvendt transcriptases og RNA polymeraser som er hemmet av tRNA 4-6. De rensede RNA fra Kirurgiske prøver blir merket ved anvendelse av standard-protokoll og hybridisert til en mikroarray chip og resultatene er analysert ved hjelp av to komplementære metoder, den såkalte falske-tode, og ved hjelp av en ny fremgangsmåte basert på gjensidig informasjon og visualiseringszed på web-basert server Retinobase 7,8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utviklingen av en prosedyre for utvinning vev fra det kirurgiske blokken har vært avgjørende for transkriptomet analyse av netthinneavløsning. Man bør legge merke til at denne type kirurgi er praktisert i krise og at øyeleger opererer har liten tid til å delta i et biologisk forskningsprogram når de opererer. Dette retinectomy er også utført stokastisk i hver enkelt tjeneste, slik at enklere måte å nå statistiske tall på er å arbeide med et nettverk. I et slikt nettverk, er standardisering av vev samling a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Sacha Reichman og Dominique Santiard-Baron for deres hjelp i å redigere RNA rensing protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Aventi J-E | |
| Rotor | Beckman Coulter | JS-5.3 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | LE 80K | |
| Rotor | Beckman Coulter | SW41 | |
| Power supply | Biorad | Pac 3000 | |
| PolytronTM | Kinematica | PT 2100 | Supplied with PT-DA 2105:2 |
| Agarose gel electrophoresis device | Biorad | MiniGel Cell GT | |
| Imaging System | Biorad | GelDoc-It Imager | |
| 5 ml sterile polyethylene tube | Greiner | 115261 | |
| Sterile polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| Chemical reagents | Sigma | Molecular biology grade (RNase and DNase free products) | |
| Cleaning Solution | VWR | RBS | |
| Microarray chip | Affymetrix | Human U133 plus 2 array |
References
- Mitry, D., Charteris, D. G., et al. The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations. The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678 (2010).
- Green, R. E., Krause, J., et al. A draft sequence of the Neandertal genome. Science. 328 (5979), 710 (2010).
- Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation. Biochemistry. 13 (12), 2633 (1974).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663 (1990).
- Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro. Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315 (1975).
- Sawadogo, M. On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin. Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261 (1981).
- Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death. PloS ONE. 6 (12), e28791 (2011).
- Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina. BMC Genomics. 9, 208 (2008).
- Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425 (2007).
- Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16 (2010).
- Chalmel, F., Leveillard, T., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).
