Transcriptomic Analys av mänskliga Retinal Kirurgiska prover med tidning
Summary
Vi använde retinal prover från retinectomy för en transcriptomic analys av näthinneavlossning. Vi utvecklade ett förfarande som gör RNA bevarande mellan de kirurgiska blocken och laborationer. Vi standardiserat ett protokoll för att rena RNA från cesiumklorid ultracentrifugering för att säkerställa att de renade RNA är lämpliga för microarray analys.
Abstract
Näthinneavlossning (RD) beskriver en separation av sensorineural näthinnan från retinala pigmenterade epitel (RPE). RPE är viktigt för normal funktion av ljuskänsliga nervceller, fotoreceptorer. Detachment av näthinnan från RPE skapar ett fysiskt gap som är fylld med extracellulär vätska. RD initierar cellulära och molekylära biverkningar som påverkar både sensorineural näthinnan och RPE eftersom den fysiologiska utbyte av joner och metaboliter allvarligt störs. Konsekvensen för visionen är relaterad till den tid lossnar sedan en snabb reapposition av de två vävnader resulterar i restaurering av visionen 1. Behandlingen av RD är enbart kirurgiskt. Borttagning av glaskroppen gel (vitrektomi) följs av avlägsnande icke väsentlig del av näthinnan runt fristående område att favorisera näthinneavlossning. De avlägsnade retinal exemplar är res nullius (ingenting) och följaktligen normalt kasseras.Att återvinna RNA från dessa kirurgiska exemplar, utvecklade vi proceduren Journal som gör RNA beskydd under överföringen från kirurgiska blocket till laboratoriet. Vi har också standardiserat ett protokoll för att rena RNA från cesiumklorid ultracentrifugering för att säkerställa att de renade RNA är lämpliga för global genuttrycksanalys. Kvaliteten på RNA validerades både genom RT-PCR och microarray analys. Analys av data visar en samtidig medverkan av inflammation och ljusmätare degeneration under RD.
Introduction
Den huvudsakliga terapeutiska mål i näthinneavlossning (RD) är att hitta ett sätt att begränsa skadorna fotoreceptorcell och retinal inflammation som resulterar från separationen av fotoreceptorer från de retinala pigmenterade epitelceller. Under RD, är RPE-celler aktiveras, migrera, dedifferentiate och föröka sig på ytan av näthinneavlossning, utövar sammandragande krafter som leder till komplikationer. Transkriptomik analys av RD är ett sätt att identifiera målgener med modifierad uttryck efter RD och därmed framtida terapeutiska molekyler som skulle kunna förbättra slutliga visuella resultatet i kombination med kirurgi. Det är väl känt ribonukleinsyra (RNA) är inte stabil som är deoxiribonukleinsyra (DNA), varvid den senare används i stor utsträckning för genetiska studier, hade dess stabilitet tillät sekvensering av neandertalarnas genom från paleontologiska prover av mer än 30.000 år 2. Transkription av DNA av generna från genomet till budbärar-RNA är denviktig process i genuttryck, och mRNA är labil för att utgöra en signal. RNA är mycket snabbt bryts ned av RNAse enzymer som avslutar signalen. När vävnaderna isoleras från en organism, de RNA är ofta nedsatt före uttrycket studeras i ett forskningslaboratorium. Degraderade RNA är inte lämpligt för analys genuttryck. Eftersom laboratoriet personalen inte kan delta i operationen, utvecklade vi ett förfarande som är enkelt och kräver bara att kirurgen att återställa vävnader till ett lämpligt RNAse-fri lösning. De RNA av vävnaderna är stabil och kan analyseras utan några tecken på nedbrytning efter 72 h vid rumstemperatur i denna lösning. De RNA från prover renas genom en standardiserad metod som innebär en ultracentrifugering på en cesiumkloridgradient efter att ha överförts till laboratoriet 3. Därefter, är kvaliteten på de RNA bedömas av agarosgelelektrofores och med RT-PCR. RNA reningsprotokoll harfördel att separera molekyler enligt deras densitet som är olika för DNA och RNA och säkerställer att RNA inte är förorenad av en DNA-molekyler som kommer att generera artefaktuella signaler i genuttrycksstudier. Dessutom är de transfer-RNA (tRNA), som är kvantitativt de mest förekommande RNA inuti en cell, separeras enligt samma fysikaliska egenskapen från det ribosomala RNA (rRNA) och budbärar-RNA (mRNA), de två senaste är den slutprodukten av reningsprocessen. Avlägsnandet av tRNA från beredningen är användbart eftersom de flesta av microarray analysprotokoll innefattade användning av omvänt transkriptas och RNA polymeraser som hämmas av tRNA 4-6. De renade RNA från kirurgiska preparat är märkta enligt standardprotokoll och hybridiserades till en mikromatrisskivan och resultaten analyseras med två kompletterande metoder, den falska upptäckten dagskursmetoden, och med hjälp av en ny metod som bygger på ömsesidig information och visualiseringzed på webbaserade server Retinobase 7,8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utvecklingen av ett förfarande för vävnad återhämtning från kirurgiska blocket har varit avgörande för transkriptomanalys av näthinneavlossning. Man bör notera att denna typ av kirurgi praktiseras i nöd och att ögonläkare operativsystemet har lite tid för att delta i ett biologiskt forskningsprogram när de är verksamma. Denna retinectomy utförs också stokastiskt i varje tjänst, så att det enklare sätt att nå statistiska siffror är att arbeta med ett nätverk. I ett sådant nätverk, är standardis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Sacha Reichman och Dominique Santiard-Baron för deras hjälp med att redigera RNA reningsprotokollet.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Aventi J-E | |
| Rotor | Beckman Coulter | JS-5.3 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | LE 80K | |
| Rotor | Beckman Coulter | SW41 | |
| Power supply | Biorad | Pac 3000 | |
| PolytronTM | Kinematica | PT 2100 | Supplied with PT-DA 2105:2 |
| Agarose gel electrophoresis device | Biorad | MiniGel Cell GT | |
| Imaging System | Biorad | GelDoc-It Imager | |
| 5 ml sterile polyethylene tube | Greiner | 115261 | |
| Sterile polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| Chemical reagents | Sigma | Molecular biology grade (RNase and DNase free products) | |
| Cleaning Solution | VWR | RBS | |
| Microarray chip | Affymetrix | Human U133 plus 2 array |
References
- Mitry, D., Charteris, D. G., et al. The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations. The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678 (2010).
- Green, R. E., Krause, J., et al. A draft sequence of the Neandertal genome. Science. 328 (5979), 710 (2010).
- Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation. Biochemistry. 13 (12), 2633 (1974).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663 (1990).
- Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro. Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315 (1975).
- Sawadogo, M. On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin. Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261 (1981).
- Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death. PloS ONE. 6 (12), e28791 (2011).
- Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina. BMC Genomics. 9, 208 (2008).
- Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425 (2007).
- Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16 (2010).
- Chalmel, F., Leveillard, T., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).
