Transcriptomic Analys av mänskliga Retinal Kirurgiska prover med tidning

Summary

Vi använde retinal prover från retinectomy för en transcriptomic analys av näthinneavlossning. Vi utvecklade ett förfarande som gör RNA bevarande mellan de kirurgiska blocken och laborationer. Vi standardiserat ett protokoll för att rena RNA från cesiumklorid ultracentrifugering för att säkerställa att de renade RNA är lämpliga för microarray analys.

Abstract

Näthinneavlossning (RD) beskriver en separation av sensorineural näthinnan från retinala pigmenterade epitel (RPE). RPE är viktigt för normal funktion av ljuskänsliga nervceller, fotoreceptorer. Detachment av näthinnan från RPE skapar ett fysiskt gap som är fylld med extracellulär vätska. RD initierar cellulära och molekylära biverkningar som påverkar både sensorineural näthinnan och RPE eftersom den fysiologiska utbyte av joner och metaboliter allvarligt störs. Konsekvensen för visionen är relaterad till den tid lossnar sedan en snabb reapposition av de två vävnader resulterar i restaurering av visionen ^1. Behandlingen av RD är enbart kirurgiskt. Borttagning av glaskroppen gel (vitrektomi) följs av avlägsnande icke väsentlig del av näthinnan runt fristående område att favorisera näthinneavlossning. De avlägsnade retinal exemplar är res nullius (ingenting) och följaktligen normalt kasseras.Att återvinna RNA från dessa kirurgiska exemplar, utvecklade vi proceduren Journal som gör RNA beskydd under överföringen från kirurgiska blocket till laboratoriet. Vi har också standardiserat ett protokoll för att rena RNA från cesiumklorid ultracentrifugering för att säkerställa att de renade RNA är lämpliga för global genuttrycksanalys. Kvaliteten på RNA validerades både genom RT-PCR och microarray analys. Analys av data visar en samtidig medverkan av inflammation och ljusmätare degeneration under RD.

Introduction

Den huvudsakliga terapeutiska mål i näthinneavlossning (RD) är att hitta ett sätt att begränsa skadorna fotoreceptorcell och retinal inflammation som resulterar från separationen av fotoreceptorer från de retinala pigmenterade epitelceller. Under RD, är RPE-celler aktiveras, migrera, dedifferentiate och föröka sig på ytan av näthinneavlossning, utövar sammandragande krafter som leder till komplikationer. Transkriptomik analys av RD är ett sätt att identifiera målgener med modifierad uttryck efter RD och därmed framtida terapeutiska molekyler som skulle kunna förbättra slutliga visuella resultatet i kombination med kirurgi. Det är väl känt ribonukleinsyra (RNA) är inte stabil som är deoxiribonukleinsyra (DNA), varvid den senare används i stor utsträckning för genetiska studier, hade dess stabilitet tillät sekvensering av neandertalarnas genom från paleontologiska prover av mer än 30.000 år ^2. Transkription av DNA av generna från genomet till budbärar-RNA är denviktig process i genuttryck, och mRNA är labil för att utgöra en signal. RNA är mycket snabbt bryts ned av RNAse enzymer som avslutar signalen. När vävnaderna isoleras från en organism, de RNA är ofta nedsatt före uttrycket studeras i ett forskningslaboratorium. Degraderade RNA är inte lämpligt för analys genuttryck. Eftersom laboratoriet personalen inte kan delta i operationen, utvecklade vi ett förfarande som är enkelt och kräver bara att kirurgen att återställa vävnader till ett lämpligt RNAse-fri lösning. De RNA av vävnaderna är stabil och kan analyseras utan några tecken på nedbrytning efter 72 h vid rumstemperatur i denna lösning. De RNA från prover renas genom en standardiserad metod som innebär en ultracentrifugering på en cesiumkloridgradient efter att ha överförts till laboratoriet ^3. Därefter, är kvaliteten på de RNA bedömas av agarosgelelektrofores och med RT-PCR. RNA reningsprotokoll harfördel att separera molekyler enligt deras densitet som är olika för DNA och RNA och säkerställer att RNA inte är förorenad av en DNA-molekyler som kommer att generera artefaktuella signaler i genuttrycksstudier. Dessutom är de transfer-RNA (tRNA), som är kvantitativt de mest förekommande RNA inuti en cell, separeras enligt samma fysikaliska egenskapen från det ribosomala RNA (rRNA) och budbärar-RNA (mRNA), de två senaste är den slutprodukten av reningsprocessen. Avlägsnandet av tRNA från beredningen är användbart eftersom de flesta av microarray analysprotokoll innefattade användning av omvänt transkriptas och RNA polymeraser som hämmas av tRNA ^4-6. De renade RNA från kirurgiska preparat är märkta enligt standardprotokoll och hybridiserades till en mikromatrisskivan och resultaten analyseras med två kompletterande metoder, den falska upptäckten dagskursmetoden, och med hjälp av en ny metod som bygger på ömsesidig information och visualiseringzed på webbaserade server Retinobase ^7,8.

Protocol

Ett. Journal: förfarandet för att uppbära Prover från Surgical Block

I labbet

1. Få en import kontrakt från expressfrakt företag.
2. Fyll 10 (eller 25) sjöfart former med postadress på laboratoriet anger kontaktperson i laboratoriet (telefonnummer och e-postadress).
3. Förbered 10 (eller 25) prover former numrerade 1 till 10 (eller 25). Dessa former omfattar särskilda utrymmen för att informera om a) anonym identifiering av patienten, b) dagen för kirurgi och c) Eventuella ytterligare upplysningar som kirurgen skulle vilja tillägga. Förbered 10 (eller 25) vadderade kuvert (150 x 210 mm).
4. Framställdes med hjälp av RNAs-fritt reagens 25 (eller 65) ml av 6 M guanidin-klorid i dietylpyrokarbonat (DEPC)-behandlat _H2O (GHCL).
5. Fyll 10 eller 25 numrerade 5 ml sterila polyetenrör rund botten med 2,4 ml GHCL lösning.
6. Används argongas för att fylla den övre delen av dessa rör, än tryck tightly på locket för att förhindra oxidation av den GHCL lösningen under flera års lagring i den kirurgiska skåpet.
7. Introducera varje 5 ml rör i en 50 ml steril polypropen konisk botten rör med skruvlock. Använd en bit ren pappersnäsduk att hålla 5 ml rör i 50 ml tub, förslut röret.
8. Placera 50 ml rör på en polystyren rack och rack i en kartong med vadderade kuvert, sjöfarten former, de provexemplar former.
9. Klistra instruktionerna (se: 1,12-1,19) insidan av locket på kartongen för att underlätta läsningen.
10. Skicka kartongen per post till kontaktpersonen på sjukhuset.

På sjukhuset

11. Ta med kartongen från kirurgiska skåpet till kirurgiska rummet. Akta Obs: om försöket innebär en nedsatt immunförsvar patienten bör kartong inte föras till den kirurgiska rummet.
12. Under operationen, placera näthinnan specimsv i numrerade 5 ml sterilt polypropen fylld med GHCL lösning. Stäng tätt röret.
13. Återgå röret en kort stund.
14. Placera röret på blod röret rocker under 10 min.
15. Fyll i det bifogade provet numrerade formulär.
16. Rapportera identifikationsnumret på motsvarande numrerade 50 ml tub.
17. Introducera 5 ml tub med kirurgiska provet i 50 ml tub, byt papper vävnad och skruva fast röret.
18. Introducera röret och den fyllda provet form till den i en av de medföljande vadderade kuvert. Stäng den.
19. Ring Express rederiet för plocka upp.

2. RNA Rening

I labbet

1. Homogenisera provet i 5 ml rör polypropylen med GHCL lösning med en homogenisator för 1 minut medan du flyttar röret upp och ner.
2. Lägg 270 pl 2 M kalium 5,0 pH. Skaka kraftigt i 10 minuter genom att placera röret på en shaker i sinhorisontellt läge (420 min ^-1).
3. Centrifugera 10 min vid 5000 rpm (6500 x g) vid 20 ° C.
4. Sug smidigt den lösliga fraktionen utan att störa pelleten.
5. Överför till en 14 ml sterilt rör.
6. Lägg 5,3 ml av 100 mM Tris pH 8,0, N-lauroylsarkosin 1%.
7. Lägg 3,2 g cesiumklorid (CsCl) och blanda röret genom virvling.
8. Lägg 1,8 ml CsCl / etylendiamintetraättiksyra (EDTA) i en steril 11 ml polyallomer centrifugrör.
9. Med en 10 ml steril Pasteur pipett RNA lösningen på 1,8 ml CsCl / EDTA genom att skjuta långsamt på kanten av röret för att undvika att störa densitet kudde.
10. Placera rören (ett andra rör innehållande buffertar utan näthinnan om det behövs) i rotorn.
11. Centrifugera 24 h vid 32.000 rpm (225.000 x g) vid 20 ° C.
12. Ta den överlägsna del av lösningen med en steril Pasteur pipett och kassera den.
13. Ta bort gradvis medan du kontrollerarögonblick när DNA (trögflytande) sugs med en andra steril Pasteur pipett och kassera den.
14. Ta den kvarvarande lösningen till att inte släppa RNA pelleten med en tredje steril Pasteur pipett.
15. Dela in botten av röret med en skalpell flame-steriliseras, sedan lägga den återstående delen av röret den upp och ner på en steril blick.
16. Omvänd röret och skölj försiktigt med 160 pl GHCL.
17. Låt pelleten torka i 10 min.
18. Återsuspendera pelleten i 150 | il (10 mM Tris pH 7,5 till 1 mM EDTA - 0,1% SDS).
19. Överför lösningen till en 2 ml sterilt mikrocentrifugrör, sedan skörda den kvarvarande pelleten med 30 | il (10 mM Tris pH 7,5 till 1 mM EDTA - 0,1% SDS).
20. Tillsätt 150 | il (10 mM Tris pH 7,5 till 1 mM EDTA).
21. Lägg 30 pl av 3 M natriumacetat pH 5,0, virvel röret.
22. Lägg 900 fil etanol 100% (-20 ° C), skaka röret.
23. Placera röret 30 min i smältande is.
24. Centrifuge röret 30 min vid 15000 rpm vid 4 ° C.
25. Sug försiktigt den lösliga fraktionen, och kassera den.
26. Tillsätt 500 l 70% etanol (RT), vortex röret.
27. Centrifugera röret 20 min vid 15.000 rpm (18.000 x g) vid 4 ° C.
28. Upprepa sköljningssteget (70% etanol).
29. Centrifugera kort och eliminera den kvarvarande etanolen med en P200 pipett.
30. Låt pelleten lufttorka i 10 min.
31. Återsuspendera pelleten i 50 | il DEPC-behandlat _H2O
32. Blanda kraftigt genom att vortexa.
33. Inkubera 15 minuter vid 45 ° C i ett vattenbad.

Tre. RNA-analys med gelelektrofores

1. Häll en agarosgel inuti ett dragskåp.
2. I ett sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör, tillsätt 2 pl av RNA som skall analyseras och 6,4 il prov prep buffert.
3. I en andra 1,5 ml rör, tillsätt 3 pl RNA standarder och 9,6 pl prov prep buffert.
4. Värm rören 15 min vid 65 ° C, Lägg dem på is.
5. Tillsätt 1 l etidiumbromid (EB) laddningsbufferten utan färgämne i RNA provröret och 1 ^ EB lastning buffert med färgämne i RNA standarder röret.
6. Kör gel under 80 - 100 V Inuti en kemisk huva i rinnande buffert, tills en av färgämnena (bromfenolblått) når 2/3 av botten av gelén.
7. Skölj gelen två gånger 15 minuter med 250 ml de DEPC-behandlat 2x SSC.
8. Ta en digitaliserad bild under UV-belysning.
9. Beräkna förhållandet mellan det övre bandet (23S rRNA) och det undre bandet (16S rRNA).

4. Slutlig rening av RNA

1. Justera volymen av RNA-provet till 100 | al med DEPC-behandlat _H2O (vid behov).
2. Lägg 100 pl av Acid fenol (1 ml fenol mättad i DEPC-behandlat _H2O + 130 pl av 50 mM natriumacetat, pH 5,2), skaka kraftigt.
3. Centrifugera 10 min vid 13.000 rpm (15.000 x g) vid rumstemperatur.
4. Recover omsorgsfullt och överför vattenfasen (övre fasen) i en roman en steril 1,5 ml mikrocentrifugrör.
5. Tillsätt 10 | il 3 M natriumacetat, pH 5,2 och 250 fil etanol 100% (-20 ° C).
6. Inkubera röret 30 min in smältande is.
7. Centrifugera röret 30 min vid 14.000 rpm (18.000 x g) vid 4 ° C.
8. Sug försiktigt den lösliga fraktionen, och kassera den.
9. Lägg 500 pl av 70% etanol (rumstemperatur) och virvelblandades röret.
10. Centrifugera röret 20 min vid 14.000 rpm (18.000 x g) vid 4 ° C.
11. Upprepa sköljningssteget (70% etanol).
12. Centrifugera kort och eliminera den kvarvarande etanolen med en P200 pipett.
13. Låt lufttorka pelleten i 10 min.
14. Resuspendera pelleten i 50 | il DEPC-behandlat _H2O
15. Inkubera sedan röret 15 min vid 45 ° C.
16. Mät absorbansen (Abs) vid 260 nm och 280 nm på 2 | il av RNA-provet. Beräknat förhållandet Abs260/Abs280.
<li> Förvara RNA-prov vid -80 ° C (stabil under flera år).

Fem. Lösningar och rengöring

1. Kaliumacetat 2 M, pH 5,0: Lös 19,6 g Kaliumacetat i 70 ml DEPC behandlade H ₂ O. Rengör proben pH-mätare genom att blötlägga den in med 1 M NaOH under 15 min, följt av 5 sköljningar med DEPC-behandlat _H2O Justera till pH 5,0 med ättiksyra justera därefter volymen till 100 ml med DEPC-behandlat _H2O
2. Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, N-lauroylsarkosin 1%: Lös 2 g N-lauroylsarkosin (under en huv) i till 40 ml 0,5 M Tris-bas pH 8,0. Justera volymen till 200 ml med DEPC-behandlat _H2O) CsCl / EDTA: 96 g CsCl i 50 ml 10 mM EDTA pH 7,5 beredd med DEPC-behandlat _H2O Autoklav och justera volymen till 100 ml med DEPC-behandlat _H2O Kontrollera att pH <7,5.
3. Agarosgel 1%: Sätt 1 g agaros i 62 ml DEPC-behandlat _H2O Koka i en mikrovågsugn. Lägg 18 ml 12,3 Mformaldehyd, 20 ml 5x MOPS. Häll i en kemisk huva.
4. Sample Prep Buffer: Att vara förberedd extemporary. Blanda i ett dragskåp 8 pl 5x MOPS, 16 fil 12,3 M formaldehyd och 40 il formamid.
5. EB buffert (utan färgämne): Att vara förberedd extemporary. Tillsätt 4 | il 10 mg / ml etidiumbromid i 20 ul av 80% glycerol framställdes med DEPC-behandlat _H2O
6. EB buffert (med färgämne): Att vara förberedd extemporary. Tillsätt 2 | il 10 mg / ml etidiumbromid i 10 pl av 80% glycerol innehållande 0,25% xylen cyanol, 0,25% bromfenolblått med DEPC-behandlat _H2O
7. Löpbuffert: till 60 ml 5x MOPS, tillsätt 54 ml 12,3 M formaldehyd och 186 ml DEPC-behandlat _H2O
8. DEPC-behandlat _H2O: Inkubera destillerat vatten med 0,1% volym / volym dietylpyrokarbonat under 2 h vid 37 ° C under omröring. Sterilisera genom Autoklav.
9. Rengöring av homogeniseraren: Tillsätt 25 ml rengöringslösning (RBS) till 1 L av DEPC-behandlat _H2O, och immerge axeln 1 min med omröring. Inkubera 2 h vid 60 ° C. Skölj noga med DEPC-behandlat _H2O Wrap instrumentet i aluminium och sätta in i instrumentet rutan. Slå in lådan. Sterilisera genom Autoklav.
10. Rengöring av elektroforesanordningen: Tvätta apparaten, facket och 15-brunnar kam. Inkubera 15 min i 3% väteperoxid. Skölj en gång med 100% etanol. Lufttorka.
11. Rengöring av glas rätter: Rengör glasskålar RBS 2% hela natten, skölj sedan med destillerat vatten före sterilisering vid 200 ° C.

Representative Results

Förfarandet Journal (figur 1) ger oss återvinna exemplar av näthinnan från kirurgiska blocket till renat RNA, och att analysera transcriptomen av näthinneavlossning. Näthinneavlossning resulterar i uppreglering av monocytkemotaktisk MCP1 gen CCL2, och i en minskning i uttryck av stången fotoreceptor transducerande gen GNAT1, den kortvågs konen opsin OPN1SW och homeogene CRX (Figur 2). Induktionen av CCL2 leder från inflammation ^9, medan den åtföljande minskningen av GNAT1, OPN1SW och CRX är resultatet av fotoreceptor degeneration, både stavar och koner. Förlusten av koner kan resultera från förlusten av uttryckning av NXNL1, vilken kodar för en Rod-härledd Cone Viability Factor ^7,10, eller dess paralog RdCVF2, vilken kodas av den NXNL2 genen. Överraskande, NXNL2 budbärare exnalister i två olika versioner. Version 1 (NM_001161625.1) är en kodande sekvens härledd från fylogenetiska analys men har inte tidigare rapporterats för att uttryckas ^11, medan version 2 (NM_145283.2), för vilket flera EST-sekvenser har identifierats är en onormal mRNA som utesluter den andra exon av genen och innehåller en alternativ andra exonen, innehållande en repetitiv Alu-sekvens, som ligger mer än 40 kb i 3'-riktningen (figur 3a). Använda RNA renat från humant näthinnan, kan vi rapporterat nu att de två versionerna av NXNL2 mRNA uttrycks (figur 3b).

Figur 1. Bild på kartongen som innehåller material som tillhandahållits av Journal.

Figur 2. Representation av uttrycket av en underuppsättning av gener med användande Retinobase. För de gener som visas i dessa radar grafer, CCL2, GNAT1, OPN1SW och CRX, motsvarar den högra delen av figuren till RNA från prover av näthinnans avdelningar (RD1-18), medan den vänstra delen (NR1-18) är RNA från ålder-matchade kontroller som framställts med hjälp av post-mortem näthinnor. Radarn grafen Metoden beskrivs i ^8.

Figur 3. Uttryck av de två versionen av NXNL2 genen i näthinnan. en. Schematisk representation av NXNL2 genen på kromosom 9. NXNL2v1 har två exoner som förutspås av multipel inriktning och fylogenetiska analys. NXNL2v2 saknas att andra exonen och inkluderar en alternativ exon 2 ", som ligger> 40 kb i 3'-riktningen. Than Pilarna visar positionen för den använda primern. b.. RT-PCR som visar uttrycket av både NXNL2v1 och NXNL2v2 i näthinnan. De rätta körfält motsvarar reaktionen i frånvaro av omvänt transkriptas. ACTB, cytoplasmisk aktin. Använda primrarna: NXNL2v1: 5'-GCATGAGCTGAGGAAGAGGT-3 ', 5'-CTCA AACGGAGAAATTCTGGA-3', NXNLv2: 5'-TCTGCACCCCCACGTTTATT-3 ', 5'-AGGGCCTCCT TTTCCATCTA-3'.

Discussion

Utvecklingen av ett förfarande för vävnad återhämtning från kirurgiska blocket har varit avgörande för transkriptomanalys av näthinneavlossning. Man bör notera att denna typ av kirurgi praktiseras i nöd och att ögonläkare operativsystemet har lite tid för att delta i ett biologiskt forskningsprogram när de är verksamma. Denna retinectomy utförs också stokastiskt i varje tjänst, så att det enklare sätt att nå statistiska siffror är att arbeta med ett nätverk. I ett sådant nätverk, är standardisering av vävnader samlingen avgörande framgång för den biologiska analysen. Genom att tillhandahålla ett material, mycket lätt att använda och exakta instruktioner, som kan lagras i rumstemperatur i en operation skåp, nära den kirurgiska blocket, har vi uppmuntrat kirurgerna att delta i vår studie.

Dessutom har en standardisering av rening av RNA uppnåtts för att få det bästa av dessa dyrbara clinical prover. Samlingarna av rena RNA kan lagras i flera år vid -80 ° C och skulle kunna användas för fortsatta studier som nya genomik teknik dyker upp. Protokollet är anordnad för retinal kirurgiska prov men kan även användas med framgång för att isolera RNA från gnagare näthinnan efter dissekering. Om RNA bryts ned, a) kontrollera pH hos CsCl / EDTA-lösning. b) göra alla lösningar från oanvända kemikalier. Den största begränsningen av tekniken är den mängd utgångsmaterial som bör motsvara minst 50000 celler.

Vad skiljer den metod som används här från de flesta kommersiella reagens som att isolera totala RNA är graden av renhet. RNA är utarmat i något DNA-kontaminering som eliminerar behovet av att använda DNAse behandling som kan vara skadligt för ytterligare förfaranden. Dessutom är den totala RNA-beredningar här utarmat på tRNA, som är kända att vara potenta hämmare av RNA-polymeraser som vanligen används iamplifieringssteget innan hybridisering till microarray chips. Vi har observerat att proberna syntetiserade från dessa RNA-preparat har en mycket hög specifik aktivitet. Graden av renhet hos RNA framställdes genom att följa den här beskrivna metoden är mycket väl lämpad för microarray-hybridisering, men också för att konstruera cDNA-bibliotek av hög kvalitet och för RNA sekvensering såsom vi har observerat. Laboratoriet ska vara RNAse gratis. PH för CsCl / EDTA bör vara sur för att undvika nedbrytning av RNA genom alkalisk lys. Densiteten för CsCl / EDTA bör noggrant kontrolleras för att inte vara för hög och för att förhindra sedimentation av RNA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge	Beckman Coulter	Aventi J-E
Rotor	Beckman Coulter	JS-5.3
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	LE 80K
Rotor	Beckman Coulter	SW41
Power supply	Biorad	Pac 3000
PolytronTM	Kinematica	PT 2100	Supplied with PT-DA 2105:2
Agarose gel electrophoresis device	Biorad	MiniGel Cell GT
Imaging System	Biorad	GelDoc-It Imager
5 ml sterile polyethylene tube	Greiner	115261
Sterile polyallomer centrifuge tube	Beckman Coulter	331372
Chemical reagents	Sigma		Molecular biology grade (RNase and DNase free products)
Cleaning Solution	VWR	RBS
Microarray chip	Affymetrix	Human U133 plus 2 array