Application d'un<em> In vitro</em> DNA Assay Protection de bien visualiser les propriétés de médiation du stress de la protéine Dps
Summary
La protéine de liaison à l'ADN des cellules privées (DPS) joue un rôle crucial dans la lutte contre le stress bactérienne. Cet article traite de la purification de l'<em> E. coli</em> Dps et le protocole pour une<em> In vitro</em> Essai démontrant protection Dps médiée par de l'ADN de la dégradation par les espèces réactives de l'oxygène.
Abstract
Le stress oxydatif est un sous-produit inévitable de la vie aérobie. L'oxygène moléculaire est essentielle pour le métabolisme terrestre, mais elle participe également à de nombreuses réactions néfastes au sein des organismes vivants. La combinaison du métabolisme aérobie et de fer, qui est un autre composé essentiel pour la vie, est suffisant pour produire des radicaux grâce à la chimie de Fenton et dégrader les composants cellulaires. dégradation de l'ADN est sans doute le processus le plus dommageable impliquant radicaux intracellulaires, comme la réparation de l'ADN est loin d'être trivial. L'analyse présentée dans cet article propose une technique quantitative de mesurer et de visualiser l'effet des molécules et enzymes sur lésions de l'ADN induites par des radicaux.
L'essai de protection de l'ADN est un outil simple, rapide et robuste pour la caractérisation in vitro des propriétés protectrices de protéines ou de produits chimiques. Elle consiste à exposer l'ADN à une réaction d'oxydation nuisible et en ajoutant des concentrations variables du composé d'intérêt. La réduction ou l'augmentation de l'altération de l'ADN en fonction de la concentration du composé est ensuite visualisées par électrophorèse sur gel. Dans cet article, nous démontrons la technique du test de protection de l'ADN en mesurant les propriétés protectrices de la protéine de liaison d'ADN à partir de cellules privées (DPS). Le DPS est un mini-ferritine qui est utilisé par plus de 300 espèces de bactéries pour lutter puissamment facteurs de stress environnementaux. Ici, nous présentons le protocole de purification Dps et les conditions de dosage optimisé pour évaluer la protection de l'ADN par Dps.
Introduction
Les organismes aérobies doivent constamment composer avec les espèces réactives de l'oxygène qui peuvent endommager leur ADN ainsi que d'autres macromolécules biologiques cruciales. Un outil puissant pour contrer les effets toxiques du stress oxydatif est la protéine de liaison d'ADN à partir de cellules privées (DPS). Depuis sa découverte en 1992 du affamé E. coli culture 1, Dps a été identifié dans plus de 300 espèces de bactéries et archéobactéries 2. Régulation à la hausse massive des Dps pendant la phase stationnaire rend la protéine nucleoid associée plus fortement exprimé de E. coli dans des conditions de famine 3, 4. En outre, Dps a été montré pour préserver à la fois la viabilité bactérienne et l'intégrité de l'ADN pendant de nombreuses diverses contraintes, notamment la famine, la concentration élevée en fer, exposition à la lumière UV, le choc thermique, et le stress oxydatif 5, 6.
Structurellement, Dps auto-associés dans un complexe homo-oligomères stable de 12 monomères, which assembler en une coquille creuse sphérique. La cavité interne ~ 4,5 nm à l'échelle est accessible au solvant par des pores qui permettent le passage de petites molécules 7 extérieur, et il peut séquestrer les métaux tels que le fer minéralisées 8. L'effet protecteur de Dps tire de ses différentes activités biochimiques, qui comprennent les liaisons non spécifiques ADN 1, l'activité ferroxydase et stockage du fer 8.
Une étude détaillée des activités biochimiques bénéfiques de Dps exige d'abord sa purification. Dps purification est une procédure complexe, comme Dps doivent être séparés non seulement d'autres protéines, mais aussi de tout ADN lié 7. Notre processus de purification optimisé utilise de nombreuses techniques communes, composé de deux colonnes échangeuses d'ions et une étape de précipitation de sulfate d'ammonium. Plusieurs échanges tampons sont nécessaires, comme Dps très concentrés peuvent précipiter hors de la solution dans de faibles conditions de sel. Une fois la protéine Dps a été purifiée, Il peut être appliqué à des tests qui mesurent directement son activité ferroxydase 8, stoechiométrie DNA-binding 9, et les mécanismes de fixation du fer 10. Dps purifiées a également d'autres applications potentielles. La structure sphérique creuse du Dps a été utilisé comme échafaudage pour stocker des particules hydrophobes à l'intérieur de la cavité de la protéine 11 et même comme une chambre de réaction pour synthétiser de nouveaux nanoparticules magnétiques 12.
La capacité de protection de Dps à la médiation dommages causés par les espèces réactives de l'oxygène peut être clairement et directement démontré en utilisant le test de protection de l'ADN 13, 14. Dans cette procédure in vitro, les espèces radicalaires sont produites lorsque le fer catalyse H 2 O 2 à la dégradation par la chimie de Fenton. Ces radicaux endommager directement l'ADN présent dans la réaction et peuvent complètement se dégrader à des concentrations élevées. Deux activités DPS clés peuvent aussi contrer directement les effets de Fentla production de radicaux sur-médiatisée. Dps abaisse la concentration en fer catalytique par minéralisation, consommant du peroxyde d'hydrogène disponible dans le procédé. En outre, Dps liaison à l'ADN peut potentiellement protéger physiquement les dommages des radicaux et se condense en un petit volume avec une surface moins réactif. La combinaison de ces deux propriétés rend le dosage de la protection de l'ADN bien adapté dans le but de mesurer l'activité Dps protection.
L'essai de protection de l'ADN est très polyvalent et peut être utilisé pour une variété d'applications au-delà Dps caractérisation. Les dommages des radicaux est une forme courante de stress dans les cellules, et de nombreuses protéines et de produits chimiques sont utilisés pour la contrecarrer. Le principe général de l'épreuve, en utilisant l'intégrité de l'ADN comme marqueur pour les dommages des radicaux, peut être utilisé en combinaison avec presque aucune réaction produisant des radicaux ou agent de contrecarrer. Entre autres, le test a été utilisé avec succès pour déterminer les propriétés anti-oxydantesde K. Extrait paniculata pour une utilisation dans l'industrie alimentaire 15, pour caractériser les effets de l'acide urique sur les dommages hydroxyle médiation 16, et d'acquérir de nouvelles connaissances sur la fonction de la fourrure de la transcription des protéines de régulation 17.
Malgré les nombreuses utilisations de l'analyse dans les documents publiés, nous avons constaté que beaucoup d'optimisation et de dépannage sont nécessaires, ce qui rend la mise en place du dosage pour la première fois un processus inutilement laborieux pour de nombreux chercheurs. Le protocole que nous présentons dans cet article vise à supprimer cette barrière à l'entrée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le procédé de purification de Dps comme décrit dans cet article est très robuste. Pureté a toujours été élevé (> 99%); pas d'autres protéines apparaissent sur gels SDS-PAGE que des bandes visibles. Malgré cela, certains lots de Dps purifiés semblent avoir une activité nucléase, comme en témoigne la dégradation de l'ADN partielle lorsqu'ils sont incubés avec des concentrations très élevées de Dps. Cela pourrait indiquer la présence d'DNases très actifs à faible concentration que …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à Michela de Martino, Wilfred R. Hagen, et Kourosh Honarmand Ebrahimi pour des discussions utiles. Ce travail a été soutenu par un financement de démarrage de l'Université de Technologie de Delft.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number |
| BL21(DE3)pLysS competent cells | Promega | L1195 |
| pET-17b DNA | EMD-Millipore | 69663-3 |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 |
| HEPES | BDH | 441476L |
| Potassium hydroxide | Merck | 105033 |
| Sodium chloride | VWR | 443824T |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 |
| Protease Inhibitor Cocktail Set III | EMD-Millipore | 539134 |
| DEAE-Sepharose | Sigma-Aldrich | DFF100 |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare LS | 17-0851-01 |
| SP-Sepharose | Sigma-Aldrich | S1799 |
| Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO) | Millipore | UFC901024 |
| Ferrous Sulphate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8048 |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 |
| MOPS | Calbiochem | 475898 |
| SDS solution | Bio-Rad | 161-0418 |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 |
| Equipment | Company | Model |
| Static incubator | Hettich | INE500 |
| Shaking Incubator | New Brunswick Sc. | Inova 44 |
| Cooled centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E |
| Table-top centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Cell disrupter | Constant Systems Ltd. | TS2/40/AA/AA |
| FPLC Purifier | General Electric | AKTA |
| Airtight vials | Cole-Parmer | EW-08918-85 |
| Syringe needles | BD | 305128 |
| Pipettes | Eppendorf | Z683779-1EA, Z683795-1EA |
References
- Almiron, M., Link, A. J., Furlong, D., Kolter, R. A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli. Genes Dev. 6, 2646-2654 (1992).
- Chiancone, E., Ceci, P. The multifaceted capacity of Dps proteins to combat bacterial stress conditions: Detoxification of iron and hydrogen peroxide and DNA binding. Biochimica et biophysica acta. 1800 (8), 798-805 (2010).
- Ali Azam, T., Iwata, A., Nishimura, A., Ueda, S., Ishihama, A. Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid. J. Bacteriol. 181 (20), 6361-6370 (1999).
- Grainger, D. C., Goldberg, M. D., Lee, D. J., Busby, S. J. Selective repression by Fis and H-NS at the Escherichia coli dps promoter. Molecular Microbiology. 68 (6), 1366-1377 (2008).
- Martinez, A., Kolter, R. Protection of DNA during oxidative stress by the nonspecific DNA-binding protein Dps. J. Bacteriol. 179 (16), 5188-5194 (1997).
- Nair, S., Finkel, S. E. Dps protects cells against multiple stresses during stationary phase. J. Bacteriol. 186 (13), 4192-4198 (2004).
- Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA. Nat. Struct. Biol. 5 (4), 294-303 (1998).
- Zhao, G., Ceci, P., et al. Iron and hydrogen peroxide detoxification properties of DNA-binding protein from starved cells. A ferritin-like DNA-binding protein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 277 (31), 27689-27696 (2002).
- Ceci, P., Cellai, S., et al. DNA condensation and self-aggregation of Escherichia coli Dps are coupled phenomena related to the properties of the N-terminus. Nucleic Acids Res. 32 (19), 5935-5944 (2004).
- Ilari, A., Ceci, P., Ferrari, D., Rossi, G. L., Chiancone, E. Iron incorporation into Escherichia coli Dps gives rise to a ferritin-like microcrystalline core. J. Biol. Chem. 277 (40), 37619-37623 (2002).
- Swift, J., Wehbi, W. A., et al. Design of functional ferritin-like proteins with hydrophobic cavities. Journal of the American Chemical Society. 128 (20), 6611-6619 (2006).
- Ceci, P., Chiancone, E., et al. Synthesis of iron oxide nanoparticles in Listeria innocua Dps (DNA-binding protein from starved cells): a study with the wild-type protein and a catalytic centre mutant. Chemistry. 16 (2), 709-717 (2010).
- Ceci, P., Ilari, A., Falvo, E., Chiancone, E. The Dps protein of Agrobacterium tumefaciens does not bind to DNA but protects it toward oxidative cleavage: x-ray crystal structure, iron binding, and hydroxyl-radical scavenging properties. The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 20319-20326 (2003).
- Su, M., Cavallo, S., Stefanini, S., Chiancone, E., Chasteen, N. D. The so-called Listeria innocua ferritin is a Dps protein. Iron incorporation, detoxification, and DNA protection properties. Biochemistry. 44 (15), 5572-5578 (2005).
- Kumar, M. Protective effects of Koelreuteria paniculata Laxm. on oxidative stress and hydrogen peroxide-induced DNA damage. Phytopharmacology. 1 (5), 177-189 (2011).
- Stinefelt, B., Leonard, S. S., Blemings, K. P., Shi, X., Klandorf, H. Free radical scavenging, DNA protection, and inhibition of lipid peroxidation mediated by uric acid. Annals of Clinical and Laboratory Science. 35 (1), 37-45 (2005).
- Lopez-Gomollon, S., Sevilla, E., Bes, M. T., Peleato, M. L., Fillat, M. F. New insights into the role of Fur proteins: FurB (All2473) from Anabaena protects DNA and increases cell survival under oxidative stress. The Biochemical Journal. 418 (1), 201-207 (2009).
- Ebrahimi, K. H., Hagedoorn, P. L., Hagen, W. R. Inhibition and stimulation of formation of the ferroxidase center and the iron core in Pyrococcus furiosus ferritin. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1243-1253 (2010).
- Smith, F. E., Herbert, J., Gaudin, J., Hennessy, D. J., Reid, G. R. Serum iron determination using ferene triazine. Clinical Biochemistry. 17 (5), 306-310 (1984).
