마우스 망막 신경절 세포의 시냅스와 인공 컨덕턴스와 동적 클램프 구현
Summary
이 비디오 문서에서는 세포 기관을 패치하는 셋업 절차 및 방법 전체 마운트 마우스 망막의 신경절 세포에서 동적 클램프 레코딩을 구현하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 흥분성과 억제 시냅스 입력의 정확한 기여도 조사 및 신경 스파이크에 대한 상대적인 크기와 타이밍을 할 수 있습니다.
Abstract
신경절 세포는 망막의 출력 뉴런하고 그들의 활동은 특정 신경 회로에서 발생하는 여러 시냅스 입력의 통합을 반영합니다. 전압 클램프 전류 클램프 구성에서 패치 클램프 기술은, 일반적으로 신경 세포의 생리적 특성을 연구하고, 자신의 시냅스 입력을 특성화하는 데 사용됩니다. 이러한 기술의 응용 프로그램이 매우 유익하지만, 그들은 여러 가지 한계를 포즈. 예를 들어, 흥분성과 억제 입력의 정확한 상호 작용이 응답 출력을 결정하는 방법 정량화하기가 어렵습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 또한 전도 클램프 1, 2, 3이라는 수정 된 전류 클램프 기법, 동적 클램프를 사용하고 신경 세포의 흥분에 흥분성과 억제 시냅스 입력의 영향을 조사 하였다. 이 기술은 셀에 현재의 주입을 필요로 그 당시의 막 잠재력의 실시간 피드백에 따라 달라집니다. injecteD 전류가 소정의 흥분성과 억제 시냅스 컨덕턴스, 자신의 반전 잠재력과 세포의 순간 막 잠재력에서 계산됩니다. 실험 절차에 대한 자세한 내용은, 동적 클램프 기법의 전체 셀 구성과 고용을 달성하기 위해 세포를 클램핑 패치는이 비디오 문서에서 설명된다. 여기, 우리는 통제 조건이나 약물의 존재 생리 실험에서 얻은 다양한 전도 파형 마우스 망막 신경절 세포의 반응을 보여줍니다. 또한, 우리는 세포의 반응을 조사하기 위해 알파 함수를 사용하여 생성 된 인공 흥분성과 억제 컨덕턴스의 사용을 보여줍니다.
Introduction
망막은 안구의 뒤쪽을 안감에 가까운 투명한 신경 조직이다. 많은 연구는 첫 번째 영상 처리 단계와 시냅스 신호 전달 메커니즘을 조사하기 위해 모델로 망막을 사용합니다. 전체 마운트 준비 망막 네트워크 절개 후 그대로 남아 있기 때문에, 그것의 생리적 반응은 생체 내 조건에서 매우 유사로 시냅스 상호 작용을 연구하는 이상적인 시스템을 나타냅니다. 따라서, 그 뉴런의 속성이 패치 클램프 기술 (테크닉에 대한 리뷰를 들면, 6,9,13 참조)를 사용하여 연구 할 수있는 격리 된 망막을 사용하여. 약물 에이전트가 여러 사이트에 행동으로 특정 회로와 신경절 세포 반응에 신경 전달 물질의 정확한 공헌의 확인은, 그러나, 일반적으로 방해합니다.
빛에 망막 신경 세포의 생리적 반응, 자연 자극, 세포 내 액체로 가득 유리 피펫과 함께 기록 할 수 있습니다. 패치 CL을 사용하여앰프 기술, 빛의 자극에 신경 반응은 막 전위 변동 (현재 클램프) 또는 전류 (전압 클램프)로 기록 할 수 있습니다. 다른 전압에서 막 잠재력을 보유하고 사후 전도성 분석을 구현하여, 그것을 억제 및 흥분성 시냅스 입력하기 5,12를 분리 할 수 있습니다. 실험의이 유형은 일반 목욕 중간에 다른 신경 전달 물질과 신경 반응에 대한 수용체의 기여를 분리하는 다른 약물 에이전트의 존재에서 수행 할 수 있습니다. 많은 실험실에서 연구의 풍부한 급상승 출력과 자극의 크기와 같은 속성, 명암, 공간과 시간적 주파수, 방향, 방향 및 기타 자극 변수에 대한 흥분성과 억제의 입력 의존도를 특징. 이 실험 방법은 스파이크 출력과 자극 특성의 함수로서 시냅스 입력 사이의 관계에 대한 정보를 제공하지만은,세포의 흥분에 특정 세포 유형과 시냅스 입력의 기여의 해석은 간단하지 않습니다. 이는 일반적으로 흥분성과 억제를 모두 입력이 자극 특성에 따라 다양하기 때문에, 그것은 이러한 입력 중 하나의 변화가 신경 세포의 스파이크에 미치는 정확한 영향을 평가하는 것은 불가능하기 때문이다.
이러한 제한을 우회 할 수있는 다른 방법은 출력을 급상승 개별 시냅스 입력의 공헌의 중요한 평가를 허용 동적 클램프 레코딩을 수행하는 것입니다. 동적 클램프 기법은 셀에 전류를 직접 주입 할 수 있으며 주어진 시간에 전류 주입의 양이 그 시간 1,2,3 (검토를 위해, 7,14 참조)에 기록 된 막 잠재력에 따라 달라집니다. 그것은 수정 된 전류 클램프 셋업입니다 녹음 아래 셀 특수 하드웨어를 구성하는 장비, 소프트웨어 사이의 실시간, 빠른 피드백의 상호 작용그리고 컴퓨터가 달성된다. 셀에 전류 주입의 양이 따라 계산됩니다. 따라서,이 방법의 장점은 셀이 전도 파형의 다른 조합으로 자극 할 수 있고, 그 반응은 시냅스 입력을 중재하는 수용체의 활성화를 모방하는 것입니다. 예를 들어, 작은 장소에 대한 흥분 전도의 주입에 대한 응답과 작은 스폿 흥분성과 억제 컨덕턴스의 주입 반응의 비교는 세포 반응에 대한 억제의 영향에 대한 정보를 제공합니다. 마찬가지로, 생리 학적 기록 컨덕턴스의 다른 조합은 스파이크 출력에 영향을주는 방법에 자극 따라 흥분성 및 / 또는 억제 컨덕턴스의 변화에 공개하는 공동 주입 할 수 있습니다.
본 연구에서는 동적 클램프 기술은 상대적으로 진폭과 망막 신경절 세포의 발화 특성에 시냅스 입력 타이밍의 영향을 설명하는 데 사용됩니다. 다양한 컨덕턴스제어 상태 또는 약물 에이전트의 존재 생리 실험에서 얻은 입력으로 고용되었다. 또한, 알파 기능에 따라 인공 컨덕턴스는 시냅스 입력이 뉴런으로 통합하는 방법을 조사하기 위해 사용되었다. 따라서이 전도의 다양한 종류가 약리학이나 계산 같은 신경절 세포에 주입하는, 어느 생리적 생성이 입력에 대한 응답이 너무 비교가 될 수 있도록하는 다양한 기술입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 비와 여기와 망막 신경절 세포의 출력 억제의 상대적 타이밍의 영향을 평가하는 동적 클램프의 사용을 보여줍니다. 동적 클램프는 살아있는 신경 세포에 생리 학적 기록 또는 인공 시냅스 컨덕턴스를 소개하는 컴퓨터 시뮬레이션을 사용합니다. 이 방법은 컨덕턴스가 수정 및 신경 반응에 미치는 영향을 계산하는 신경 세포에 주입 할 수있는 대화 형 도구를 제공합니다. 전도 파?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 생명 과학의 징계에서 호주 연구 협의회 (ARC DP0988227)과 생명 과학 연구 이니셔티브 그랜트, 시드니의 대학에 의해 지원됩니다. 장비 패치 클램프 증폭기는 EPC 8 생명 과학, 시드니 대학의 징계에서 시작 기금에 의해 투자되었다. 장비 InstruTECH LIH 8 +8 데이터 수집 시스템은 레베카 L. 쿠퍼 재단과 생명 과학, 시드니 대학의 징계에서 시작 기금으로부터 자금 구입했습니다. 우리는 그들의 통찰력있는 제안과 의견을 익명의 검토를 감사하고 싶습니다.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflurane Inhalation Anaesthetic | Pharmachem | ||
| Ames Medium with L-Glutamate (Powder) | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Gluconate, Anhydrous | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES Sodium salt | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride solution (4.9 mol/l) | Sigma-Aldrich | ||
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | ||
| Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml) | Invitrogen | ||
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml | Invitrogen | ||
| Fluorescent Preserving Media | BioFX Laboratories Inc. | ||
| Equipment | |||
| Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm) | Warner Instruments | 64-0794 | |
| Single Stage Glass Microelectrode Puller | Narishinge Japan | Model PP-830 | |
| Minipuls 2 | Gilson | ||
| Millex-GV 0.22 μm Filter Unit | Millipore Corporation | SLGV004SL | |
| Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G | Smith & Nephew (Australia) | ||
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | Model SH-27B | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Olympus Stereomicroscope SZ61 | Olympus Corporation | ||
| Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective | Olympus Corporation | ||
| 0-30 V 2.5 A DC Power Supply | Dick Smith Electronics | Q1770 | |
| Digital Microscopic Camera ProgResMF cool | Jenoptik | ||
| Micromanipulator MP-225 | Sutter Instrument Company | ||
| Patch Clamp Amplifier EPC 8 | HEKA Elektronik | ||
| InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System | HEKA Elektronik | ||
| Computer: DELL | Dell Corporation |
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