Pyrosequencing er en alsidig teknik, der letter mikrobiel genomsekvensering, der kan bruges til at identificere bakteriearter, diskriminere bakteriestammer, og påvise genetiske mutationer, som giver resistens over for antimikrobielle midler. I denne video, vil proceduren for mikrobiel amplicon generation amplikon pyrosekventering, og DNA sekvensanalyse påvises.
Pyrosequencing er en alsidig teknik, der letter mikrobiel genomsekvensering, der kan bruges til at identificere bakteriearter, diskriminere bakteriestammer og påvise genetiske mutationer, som giver resistens over for antimikrobielle midler. Fordelene ved pyrosekventering for Microbiology applikationer omfatter hurtig og pålidelig høj-throughput screening og præcis identifikation af mikrober og mikrobielle genom mutationer. Pyrosequencing indebærer sekventering af DNA ved at syntetisere den komplementære streng en enkelt base ad gangen, mens bestemmelse af specifikke nukleotid blive inkorporeret under syntesen reaktionen. Reaktionen sker på immobiliseret enkeltstrenget skabelon-DNA, hvor de fire deoxyribonucleotider (dNTP'er) tilsættes sekventielt og de inkorporerede dNTP'er er enzymatisk nedbrudt før tilsætning af den næste dNTP til syntesereaktionen. Påvisning af specifikke basen indarbejdet i skabelonen overvåges ved generation af chemiluminescent signaler. Rækkefølgen af dNTP'er, der producerer de kemiluminescerende signaler bestemmer DNA-sekvensen af templaten. Den realtid sekventering evne Pyrosequencing teknologi muliggør hurtig mikrobiel identifikation i en enkelt analyse. Endvidere, det pyrosekventering instrumentet kan analysere den fulde genetiske mangfoldighed af antimikrobiel resistens, herunder indtastning af SNP'er, punktmutationer, insertioner og deletioner, samt kvantificering af multiple genkopier, der kan forekomme i nogle anti-mikrobiel resistens mønstre.
Pyrosequencing er en hurtig og præcis metode til sekvens nukleinsyrer, der er baseret på princippet "sekvensering ved syntese". "Sekventering ved syntese" indebærer anvendelse af en enkelt streng DNA-template til at syntetisere den komplementære streng én base ad gangen, og detektion af inkorporeret base (A, T, G eller C) ved hvert trin ved påvisning af et kemiluminescerende signal. Den pyrosekventering Reaktionen omfatter template-DNA, dNTP'er (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), DNA-polymerase, ATP-sulfurylase, luciferin, luciferase og apyrase. Syntesen Reaktionen initieres ved tilsætning af et af de fire dNTP'er og DNA-polymerase til det enkeltstrengede biotinyleret template-DNA. DNA-polymerase inkorporerer komplementære dNTP på skabelonen, med den efterfølgende frigivelse af pyrophosphat (figur 1). ATP-sulfurylase forholdsmæssigt konverterer pyrophosphat til ATP. ATP fungerer som en katalysator for luciferase-medieret omdannelse af luciferin til oxyluciferin, somgenererer lys (figur 2). Intensiteten af lys er proportional med antallet af inkorporerede nukleotider og afgør om en eller flere specifikke dNTP'er (dATP, dTTP, dGTP eller dCTP) er til stede på template-strengen sekventielt (figur 3). Enhver personlige dNTP'er nedbrydes ved apyrase før tilsætning af den næste dNTP til videreførelse af syntesereaktionen. Denne "sekventering ved syntese" reaktion gentages med tilsætning af hver af de fire dNTP'er indtil DNA-sekvensen af den enkeltstrengede DNA-skabelon bestemmes.
For at se en animation af pyrosekventering reaktion Klik her for at se filmen .
Flere nye næste generation sekventering metoder er blevet kommercialiseret. Tre af de mest udbredte metoder er ion halvleder sekventering, enkelt molekyle realtid sekventering og sekventering ved syntese (SBS). 3-11 Hver af disse metoder afhænger af sekventering ved syntese, men anvender nye platforme til påvisning af de inkorporerede nukleotider. I ion halvleder sekventering, serverer en enkelt streng af DNA som en skabelon for sekventering streng. 12. Polymerase og nukleotider tilsættes sekventielt som i pyrosekventering. Når en nukleotid tilsættes til den voksende DNA-streng, er en hydrogen-ion frigivet. Hydrogen-ionen detekteres af en felteffekttransistor baseret sensor.
Enkelt molekyle realtid sekventering afhænger nul tilstand bølgeleder (ZMW). 13. ZMW er en lille struktur, hvor en enkelt polymerase molekyle er fastgjort til bunden af brønden. Det belyses på en sådan måde, at en floreduft molekyle kan detekteres. Hver nukleotid er kodet med et fluorescerende molekyle. Som en fluorescerende mærkede nukleotid inkorporeres, en detektor identificerer nukleotidet. Når den næste nucleotid tilsættes, er den fluorescerende molekyle spaltes. 14.
Sekventering ved syntese (SBS) bruger en unik metode til at opformere mål-DNA'et, således at klynger af unikke sekvenser genereres. 15 Single templates genereres og derefter den komplementære streng syntetiseres. Hvert nukleotid er mærket med et fluorescerende molekyle og efter hver basetilsætning fluorescensen af den tilsatte base registreres.
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt var støtte delvist ved Johns Hopkins University, Kontoret for Provost gennem Gateway Science Initiative og Qiagen Inc.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
PyroMark PCR Master Mix, 2x | Qiagen | 978703 | |
CoralLoad Concentrate, 10x | Qiagen | 978703, 978705 | |
Q-Solution, 5x | Qiagen | 978703, 978705 | |
MgCl2, 25 mM | Qiagen | 978703, 978705 | |
RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
Primers | Qiagen | 978776 or 978777 | Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 μM. |
Pyromark Gold Q24 Reagents | Qiagen | 970802 | |
High-purity water (Milli-Q 18.2 MΩ x cm or equivalent) | |||
Streptavidin Sepharose High Performance Beads | GE Healthcare | 17-5113-07 | |
PyroMark Annealing Buffer | Qiagen | 979009 | |
PyroMark Denaturation Solution | Qiagen | 979007 | |
PyroMark Wash Buffer | Qiagen | 979008 | |
PyroMark Q24 | Qiagen | 9001514 | |
PyroMark Q24 Cartridge | Qiagen | 979202 | |
PyroMark Q96 HS Tip Holder Box | Qiagen | 979105 | |
PyroMark Q24 Vacuum Workstation | Qiagen | 9001516 | |
PyroMark Q24 Plate Holder | Qiagen | 9022273 | |
Orbital shaker | Fisher | 11-675-297 | |
Heat block | Fisher | 11-718Q |