Pyrosequencing er en allsidig teknikk som muliggjør mikrobiell sekvenserings som kan brukes til å identifisere bakteriearter, diskriminere bakteriestammer, og detektere genetiske mutasjoner som gir resistens til anti-mikrobielle midler. I denne video, vil prosedyren for mikrobiell generering amplikon, amplikon pyrosequencing, og DNA-sekvens-analyse påvises.
Pyrosequencing er en allsidig teknikk som muliggjør mikrobiell sekvenserings som kan brukes til å identifisere bakteriearter, diskriminere bakteriestammer og detektere genetiske mutasjoner som gir resistens til anti-mikrobielle midler. Fordelene med pyrosequencing for mikrobiologi bruksområder er rask og pålitelig high-throughput screening og nøyaktig identifisering av mikrober og mikrobielle genom mutasjoner. Pyrosequencing innebærer sekvensering av DNA ved å syntetisere den komplementære tråden en enkelt base i en tid, mens bestemme den spesifikke nukleotid blir innlemmet under syntesereaksjonen. Reaksjonen skjer på immobilisert enkelttrådet mal DNA, hvor de fire deoksyribonukleotider (dNTP) tilsettes sekvensielt, og de Kommunefritt dNTP'er er enzymatisk nedbrutt før tilsetning av den neste dNTP til syntesereaksjonen. Påvisning av den spesifikke basen innlemmet i malen blir overvåket ved generering av chemiluminescent signaler. Rekkefølgen av dNTPs som produserer kjemiluminescerende signaler bestemmer den DNA-sekvensen av malen. Den sanntids evne sekvensering av pyrosequencing teknologi muliggjør hurtig mikrobiell identifisering i en enkelt analyse. I tillegg er det pyrosequencing instrument, kan analysere den fullstendige genetiske mangfold antimikrobielt medikament-resistens, inkludert typing av SNP'er, punkt-mutasjoner, innsettinger og delesjoner, samt kvantifisering av multiple genkopier som kan oppstå i noen anti-mikrobiell resistens mønstre.
Pyrosequencing er en rask og nøyaktig metode for sekvensielle nukleinsyrer som er basert på prinsippet om "sekvensering ved syntese". "Sekvensering ved syntese" involverer bruk av en enkelt streng DNA-templat for å syntetisere den komplementære tråden på en basestasjon om gangen, og å detektere den innlemmet base (A, T, G eller C) på hvert trinn etter detektering av et kjemiluminescerende signal. Den pyrosequencing reaksjon inkluderer mal DNA, dNTPs (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferin, luciferase, og apyrase. Syntesegassen Reaksjonen blir startet ved tilsetning av en av de fire dNTP'er og DNA-polymerase til den enkelkjedete biotinylert mal DNA. DNA-polymerase inneholder den komplementære dNTP på malen, med påfølgende frigjøring av pyrofosfat (figur 1). ATP sulfurylase konverterer forholdsmessig pyrofosfatet til ATP. ATP virker som en katalysator for luciferase-mediert omdannelse av luciferin til oxyluciferin, hvilkengenererer lys (figur 2). Intensiteten av lys som er proporsjonal med antallet av nukleotider innlemmes og bestemmer om en eller flere spesifikk dNTP 's (dATP, dTTP, dGTP, dCTP eller) er til stede på malen tråd sekvensielt (figur 3). Enhver ikke-inkorporerte dNTP er degradert av apyrase før tilsetning av den neste dNTP for videreføring av syntesereaksjonen. Denne "sekvensering ved syntese" reaksjon gjentas med tilsetning av hver av de fire dNTP'er til DNA-sekvensen av den enkelt-trådet DNA-templat bestemmes.
Hvis du vil se en animasjon av pyrosequencing reaksjon Klikk her for å se film .
Flere nye neste generasjons sekvensering metoder har blitt kommersialisert. Tre av de mest brukte metodene er ion halvleder sekvensering, enkelt molekyl sanntid sekvensering, og sekvensering av syntese (SBS). 3-11 Hver av disse metodene avhenger sekvensering ved syntese, men ansette nye plattformer for påvisning av de inkorporerte nukleotider. I ion halvleder sekvensering, serverer en enkelt strand av DNA som en mal for sekvensering strand. 12. Polymerase og nukleotider legges sekvensielt som i pyrosequencing. Når en nukleotid tilsettes til den voksende DNA-kjede, er en hydrogenion frigjøres. Den hydrogen-ion blir detektert av en felteffekttransistor baserte sensor.
Enkelt molekyl sanntid sekvensering avhenger null modus bølgeleder (ZMW). 13. Den ZMW er en liten struktur hvor et enkelt molekyl polymerase er festet til bunnen av brønnen. Det er belyst på en slik måte at en floreduft-molekylet kan bli detektert. Hver nukleotid er merket med et fluorescerende molekyl. Som en fluorescently merket nukleotid er innarbeidet, identifiserer en detektor nucleotide. Når neste nukleotid er lagt til, er den fluorescerende molekyl spaltes. 14.
Sekvensering ved syntese (SBS) anvender en unik metode for å forsterke den mål-DNA slik at klynger av unike sekvenser genereres. 15. enkeltstrengede maler er generert og deretter den komplementære tråden blir syntetisert. Hvert nukleotid er merket med et fluorescerende molekyl, og etter hver basetilsetning fluorescensen av den tilsatte basen tas opp.
The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet var støtte i en del av Johns Hopkins University, kontor Provost gjennom Gateway Science Initiative og Qiagen Inc.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
PyroMark PCR Master Mix, 2x | Qiagen | 978703 | |
CoralLoad Concentrate, 10x | Qiagen | 978703, 978705 | |
Q-Solution, 5x | Qiagen | 978703, 978705 | |
MgCl2, 25 mM | Qiagen | 978703, 978705 | |
RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
Primers | Qiagen | 978776 or 978777 | Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 μM. |
Pyromark Gold Q24 Reagents | Qiagen | 970802 | |
High-purity water (Milli-Q 18.2 MΩ x cm or equivalent) | |||
Streptavidin Sepharose High Performance Beads | GE Healthcare | 17-5113-07 | |
PyroMark Annealing Buffer | Qiagen | 979009 | |
PyroMark Denaturation Solution | Qiagen | 979007 | |
PyroMark Wash Buffer | Qiagen | 979008 | |
PyroMark Q24 | Qiagen | 9001514 | |
PyroMark Q24 Cartridge | Qiagen | 979202 | |
PyroMark Q96 HS Tip Holder Box | Qiagen | 979105 | |
PyroMark Q24 Vacuum Workstation | Qiagen | 9001516 | |
PyroMark Q24 Plate Holder | Qiagen | 9022273 | |
Orbital shaker | Fisher | 11-675-297 | |
Heat block | Fisher | 11-718Q |