Pyrosequencing är en mångsidig teknik som underlättar mikrobiell genomet sekvensering som kan användas för att identifiera bakteriearter, diskriminera bakteriestammar, och upptäcka genetiska mutationer som ger resistens mot antimikrobiella medel. I den här videon, kommer förfarandet för mikrobiell amplicon generation, amplikon Pyrosequencing, och DNA-sekvensanalys påvisas.
Pyrosequencing är en mångsidig teknik som underlättar mikrobiell genomet sekvensering som kan användas för att identifiera bakteriearter, diskriminera bakteriestammar och upptäcka genetiska mutationer som ger resistens mot antimikrobiella medel. Fördelarna för Pyrosequencing för mikrobiologi applikationer är snabb och tillförlitlig high-throughput screening och korrekt identifiering av mikrober och mikrobiella mutationer genomet. Pyrosequencing innebär sekvensering av DNA genom att syntetisera den komplementära strängen en enda bas i taget, medan bestämning av specifika nukleotid varelse införlivas under syntesreaktionen. Reaktionen sker på immobiliserat enkelsträngat templat-DNA där de fyra deoxiribonukleotiderna (dNTP) tillsätts sekventiellt och de unincorporated dNTP är ned enzymatiskt före tillsats av nästa dNTP till syntesreaktionen. Detektion av den särskilda bas införlivas med mallen övervakas genom alstring av chemiluminescent signaler. Ordningen på dNTP som producerar de kemiluminescenta signalerna bestämmer DNA-sekvensen av mallen. Den realtid sekvensering förmåga Pyrosequencing teknologin möjliggör snabb mikrobiell identifiering i en enda analys. Dessutom pyrosekvensering instrumentet, kan analysera den fullständiga genetiska mångfalden av antimikrobiell resistens, inklusive typning av SNP, punktmutationer, insättningar och strykningar, samt kvantifiering av multipla genkopior som kan förekomma i någon antibiotikaresistens mönster.
Pyrosequencing är en snabb och exakt metod för syror sekvens nukleinsyror som bygger på principen om "sekvensering genom syntes". "Sekvensering genom syntes" innebär att man använder en enda schablonsträng DNA för att syntetisera den komplementära strängen en bas åt gången, och detektering av den inkorporerade basen (A, T, G eller C) vid varje steg för detektering av en kemiluminescent signal. Pyrosequencing reaktion innefattar mall-DNA, dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), DNA-polymeras, ATP sulfurylas, luciferin, luciferas och apyras. Syntesen Reaktionen initieras genom tillsats av en av de fyra dNTP och DNA-polymeras till den enkelsträngade biotinylerade mall-DNA. DNA-polymeras inkorporerar den komplementära dNTP på mallen, med efterföljande frisättning av pyrofosfat (Figur 1). ATP sulfurylas omvandlar proportionellt pyrofosfatet till ATP. ATP fungerar som en katalysator för luciferas-medierad omvandling av luciferin till oxyluciferin, somgenererar ljus (Figur 2). Ljusintensiteten är proportionell mot antalet införlivade nukleotider och avgör om en eller flera särskilda dNTP (dATP, dTTP, dGTP eller dCTP) finns på mallsträngen sekventiellt (Figur 3). Varje unincorporated dNTP bryts ned av apyras före tillsats av nästa dNTP för fortsättning av syntesreaktionen. Denna "sekvensering genom syntes"-reaktion upprepas med tillsats av vardera av de fyra dNTP tills DNA-sekvensen för den enkelsträngade DNA-mallen bestäms.
Om du vill visa en animering av pyrosekvensering reaktionen Klicka här för att se filmen .
Flera nya nästa generations sekvensering metoder har kommersialiserats. Tre av de mest använda metoderna är jon halvledare sekvensering, enda molekyl realtid sekvensering, och sekvensering genom syntes (SBS). 3-11 Var och en av dessa metoder beror på sekvensering genom syntes men anställa nya plattformar för detektion av de införlivade nukleotider. I jon halvledare sekvensering, tjänar en enkel sträng av DNA som en mall för sekvensering strängen. 12 Polymeras och nukleotider tillsättes i följd som i Pyrosequencing. När en nukleotid tillsätts till den växande DNA-sträng, är en vätejon släpps. Den vätejon detekteras av en fälteffekttransistor baserad sensor.
Single molekyl realtid sekvensering beror på nollarbetsläget vågledare (ZMW). 13 Den ZMW är en liten struktur där en enda polymeras molekyl är fäst vid botten av brunnen. Det är belyst på ett sådant sätt att en floredoft molekyl kan detekteras. Varje nukleotid är märkt med en fluorescerande molekyl. Som en fluorescerande taggade inkorporeras, identifierar en detektor nukleotid. När nästa nukleotid tillsätts, är den fluorescerande molekylen klyvs. 14
Sekvensering genom syntes (SBS) använder en unik metod för att amplifiera mål-DNA, så att kluster av unika sekvenser genereras. Genereras och sedan den komplementära strängen syntetiseras 15 Enkelsträngade mallar. Varje nukleotid är märkt med en fluorescerande molekyl och efter varje bastillsats fluorescensen hos den tillsatta basen registreras.
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt var stöd delvis av Johns Hopkins University, tjänstgörande Provost via Gateway Science Initiative och Qiagen Inc.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
PyroMark PCR Master Mix, 2x | Qiagen | 978703 | |
CoralLoad Concentrate, 10x | Qiagen | 978703, 978705 | |
Q-Solution, 5x | Qiagen | 978703, 978705 | |
MgCl2, 25 mM | Qiagen | 978703, 978705 | |
RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
Primers | Qiagen | 978776 or 978777 | Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 μM. |
Pyromark Gold Q24 Reagents | Qiagen | 970802 | |
High-purity water (Milli-Q 18.2 MΩ x cm or equivalent) | |||
Streptavidin Sepharose High Performance Beads | GE Healthcare | 17-5113-07 | |
PyroMark Annealing Buffer | Qiagen | 979009 | |
PyroMark Denaturation Solution | Qiagen | 979007 | |
PyroMark Wash Buffer | Qiagen | 979008 | |
PyroMark Q24 | Qiagen | 9001514 | |
PyroMark Q24 Cartridge | Qiagen | 979202 | |
PyroMark Q96 HS Tip Holder Box | Qiagen | 979105 | |
PyroMark Q24 Vacuum Workstation | Qiagen | 9001516 | |
PyroMark Q24 Plate Holder | Qiagen | 9022273 | |
Orbital shaker | Fisher | 11-675-297 | |
Heat block | Fisher | 11-718Q |