طريقة بسيطة وفعالة لكشف النووية في تفعيل عامل العدلات الإنسان من قياس التدفق الخلوي
Summary
العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في الدم. العدلات التي تمتلك وظائف ينظم transcriptionally مثل إنتاج السيتوكينات proinflammatory و تثبيط الخلايا. يمكن دراسة هذه الوظائف مع أسلوب المعروضة هنا، والذي يسمح الكشف وتقدير من العوامل النووية في نوى التدفق الخلوي معزولة
Abstract
العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في الدم المحيطي. هذه الخلايا هي الأولى في الظهور في مواضع الالتهابات والعدوى، وبذلك أصبحت خط الدفاع الأول ضد غزو الكائنات الحية الدقيقة. العدلات المضادة للجراثيم التي تمتلك وظائف هامة مثل البلعمة، وإطلاق سراح من الإنزيمات التحللي، وإنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية. وبالإضافة إلى هذه المهام مهمة الدفاع، العدلات أداء مهام أخرى في الاستجابة للإصابة مثل إنتاج السيتوكينات proinflammatory و تثبيط الخلايا. السيتوكينات تجنيد الكريات البيض الأخرى التي تساعد مسح العدوى، وتثبيط الخلايا العدلة يسمح للعيش لفترة أطول في موقع العدوى. وينظم هذه الوظائف على مستوى النسخ. ومع ذلك، لأن العدلات هي خلايا قصيرة العمر، لا يمكن دراسة الاستجابات ينظم transcriptionally في هذه الخلايا أن يؤديها مع الطرق التقليدية الجينات مراسل حيث لا توجد ايفيآاف لتقنيات ترنسفكأيشن العدلات. هنا، نقدم طريقة بسيطة وفعالة تسمح الكشف وتقدير من العوامل النووية في نوى معزولة وimmunolabeled بواسطة التدفق الخلوي. وصفنا تقنيات لعزل العدلات نقية من الدم المحيطي الإنسان، وتحفيز هذه الخلايا المضادة للمستقبلات الأجسام المضادة، وعزل نواة immunolabel، وتحليل التدفق الخلوي من قبل النوى. وقد استخدمت بنجاح الأسلوب للكشف عن NF-كيلوبايت وإلك-1 العوامل النووية في نوى من العدلات وأنواع الخلايا الأخرى. وبالتالي، هذا الأسلوب يمثل خيارا لتحليل تفعيل عوامل النسخ في النواة معزولة من مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا.
Introduction
العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في الدم المحيطي 1. العدلات خلال الالتهاب والعدوى هي الخلايا الأولى لتظهر في موقع المتضررة حيث يكون بمثابة خط الدفاع الأول 2. العدلات تمتلك آليات عدة مضادات الميكروبات 3 بما البلعمة، وإنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية، وإطلاق سراح من الإنزيمات التحللي بواسطة تحبب، وإنتاج السيتوكينات proinflammatory 4،5. العدلات هي خلايا قصيرة الأجل التي تحصل بسرعة من خلال تفعيل الإشارات من مختلف مستقبلات سطح الخلية. وعلى الرغم من اعتبار العدلات الخلايا الطرفية بسبب حياتهم القصيرة والخضوع لأنهم موت الخلايا المبرمج إلا إذا تفعيلها خلال عملية الالتهاب 6، فمن الواضح الآن أن يتمكنوا من تعديل النمط الظاهري أيضا عن طريق تغيير مستوى النسخ جينات معينة. إنتاج السيتوكينات (5) وتثبيط الخلايا نوعان من 7،8 طmportant وظائف الخلية التي تعتمد على تفعيل تنظيم على مستوى النسخ في العدلات. النووية كيلوبايت عامل (NF-كيلوبايت) تشارك في السيطرة النسخي من 4 وإنتاج السيتوكينات في تنظيم بقاء الخلية وموت الخلايا المبرمج في 9-11 أنواع الخلايا المختلفة.
يتم دراسة مسارات الإشارات عادة التي تؤدي إلى تنشيط العامل النووي من الجينات مراسل المقايسات أو عن طريق فحوصات الكهربي التحول التنقل (EMSA). ومع ذلك، لأن العدلات هي خلايا قصيرة العمر، لا يمكن دراسة الاستجابات ينظم transcriptionally في هذه الخلايا يتم تنفيذ المقايسات مع الجينات مراسل، حيث لا توجد تقنيات فعالة لترنسفكأيشن العدلات. وقد استخدمت المقايسات EMSA في العدلات لاستكشاف النووية تفعيل عامل 12،13، ولكن هذه المنهجية هي معقدة ومكلفة لأنه ينطوي على استخدام المواد المشعة. Nucleofection هو أسلوب آخر التي استخدمت ناجحهLLY لبالنقل حيدات 14. وهكذا، على الأقل من الناحية النظرية، يمكن أن الكشف عن تفعيل النووية عامل في العدلات من ترنسفكأيشن (على الرغم من انخفاض الكفاءة). ومع ذلك، فإن هذه التقنية أن تكون أكثر تكلفة، تستغرق وقتا طويلا وربما أقل كمية. ويمكن أيضا تحليل مجهري للخلايا immunostained أن تستخدم لكشف العوامل النووية في النواة. في الواقع، لقد اكتشفنا NF-كيلوبايت إزفاء إلى النواة بهذه الطريقة 15. للأسف، هذا الأسلوب هو أيضا تستغرق وقتا طويلا، كمية أقل، وتخضع للانحياز المراقب.
هنا، نقدم طريقة بسيطة وفعالة تسمح الكشف وتقدير من العوامل النووية في نوى معزولة وimmunolabeled بواسطة التدفق الخلوي. وصفنا تقنيات لعزل العدلات من الدم المحيطي الإنسان، وتحفيز هذه الخلايا عن طريق integrins أو مستقبلات التيسير مع مستقبلات الأجسام المضادة المضادة لل، وعزل نواة immunolabel، وتحليل التدفق الخلوي من قبل النوى (Figure 1). وقد استخدمت بنجاح الأسلوب للكشف عن NF-15 و إلك كيلوبايت-1 16 العوامل النووية في نوى العدلات. حساسية هذا الأسلوب يسمح الكشف عن التغيرات الصغيرة في مستويات عامل النووي في النواة. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتحليل مستوى عوامل النسخ في النواة من أنواع الخلايا الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة تنقية صفها هنا يسمح للعزل العدلات unstimulated (السوداء) مع نقاء أكبر من 95٪ (عن طريق الملاحظة المجهرية المقررة)، في وقت قصير. يمكن في بعض الأحيان أن تكون ملوثة من قبل العدلات الكريات الحمراء إذا لم يتم هذا الأخير هي lysed تماما. هذا لا يؤثر عادة هذه التقنية، يمكن بسهولة من…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر نانسي مورا للحصول على المساعدة الفنية لها.
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المنح البحثية 48573-M و168098 من المجلس الوطني دي بحوث والتكنولوجيا ذ Ciencia، والمكسيك، والمنح وIN212308 IN205311-2 من المديرية العامة للAsuntos ديل Academico الشخصية، الجامعة الوطنية المستقلة دي مكسيكو، المكسيك.
Materials
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Mexico) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S9390 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium chloride anhydrous | Sigma | M8266 | |
| DL-dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Trypan Blue (0.4 % solution) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Monoclonal antibody IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Human-specific anti-FcRII (CD32) |
| Monoclonal antibody 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Human-specific anti-FcRIII (CD16) |
| Monoclonal antibody TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donated by Dr. Martin Hemler | Human-specific anti-β1 integrin (CD29) |
| Monoclonal antibody IB4 | University of California, San Francisco | Donated by Dr. Eric J. Brown | Human-specific anti-β2 integrin (CD18) |
| F(ab’)2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Rabbit polyclonal antibody |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Centrifuge, Sorvall Tabletop | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-meter | Corning | 340 | |
| Pipetman pipette P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman pipette P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman pipette P-1000 | Gilson | F123602 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600 | |
| Inverted microscope | Nikon | TMS | |
| Water Bath Incubator | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414C | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Flow Cytometer | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur |
References
- Sendo, F., et al. Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response. Human Cell. 9, 215-222 (1996).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
- Naussef, W. M. How human neutrophils kill and degrade microbes. An integrated view. Immunol. Rev. 219, 88-102 (2007).
- Scapini, P., et al. The neutrophil as a cellular source of chemokines. Immunol. Rev. 177, 195-203 (2000).
- Hamilton, T., et al. Cell type- and stimulus-specific mechanisms for post-transcriptional control of neutrophil chemokine gene expression. J. Leukoc. Biol. 91, 377-383 (2012).
- Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol. Rev. 193, 101-110 (2003).
- Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Molecular control of neutrophil apoptosis. FEBS Lett. 487, 318-322 (2001).
- Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game. Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).
- Green, D. R. Death and NF-κB in T cell activation: life at the edge. Mol. Cell. 11, 551-552 (2003).
- Papa, S., Zazzeroni, F., Pham, C. G., Bubici, C., Franzoso, G. Linking JNK signaling to NF-κB: a key to survival. J. Cell Sci. 117, 5197-5208 (2004).
- Valente, P., et al. TNF increases camptothecin-induced apoptosis by inhibition of NF-κB. Eur. J. Cancer. 39, 1468-1477 (2003).
- Choi, M., et al. Inhibition of NF-κB by a TAT-NEMO-binding domain peptide accelerates constitutive apoptosis and abrogates LPS-delayed neutrophil apoptosis. Blood. 102, 2259-2267 (2003).
- Wang, K., et al. Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-κB signaling pathways. J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).
- Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).
- Garcia-Garcia, E., Rosales, C. Nuclear factor activation by FcγR in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method. J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. FcγRIIA and FcγRIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils. J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).
