유동 세포 계측법에 의해 인간 호중구에 핵 팩터 활성화를 감지 할 간단하고 효율적인 방법
Summary
호중구는 혈액에서 가장 풍부한 백혈구 수 있습니다. 호중구는 전 염증성 크린 시토 킨 및 apoptosis의 억제 생산 등 transcriptionally 규제 기능을 가지고 있습니다. 이 기능은 절연 핵에 유동 세포 계측법에 의해 핵 요인의 감지 및 정량화 할 수 있습니다 여기에 제시된 방법으로 공부 할 수 있습니다
Abstract
호중구는 말초 혈에서 가장 풍부한 백혈구 수 있습니다. 이러한 세포 따라서 미생물을 침해에 대한 방어의 첫 번째 줄되고, 염증 및 감염의 사이트에 게재 처음입니다. 호중구는 phagocytosis, lytic 효소의 출시, 그리고 반응성 산소 종의 생산과 같은 중요한 항균 기능을 가지고 있습니다. 다음과 같은 중요한 방어 기능뿐만 아니라, 호중구는 전 염증성 크린 시토 킨 및 apoptosis의 억제 생산 등의 감염에 대한 응답으로 다른 작업을 수행 할 수 있습니다. 크린 시토 킨은 감염을 선명하게 할 수 다른 백혈구를 모집하고, apoptosis의 억제는 호중구는 감염의 사이트에 더 오래 살 수 있습니다. 이 함수는 스크립트 수준의 규제를받습니다. 호중구는 수명이 짧은 세포이기 때문에 더 effi가 없기 때문에 그러나, 이러한 세포의 transcriptionally 규제 응답의 연구는 종래의 리포터 유전자 방법으로 수행 할 수 없습니다호중구 transfection에 대한 cient 기술. 여기, 우리는 유동 세포 계측법에 의한 분리 및 immunolabeled 핵의 핵 요인의 감지 및 정량화 할 수있는 간단하고 효율적인 방법을 제시한다. 우리는 인간의 말초 혈액에서 순수 호중구를 분리하는 기술을 설명, 안티 – 수용체 항체와 함께이 세포를 자극 분리하고 immunolabel의 핵 및 유동 세포 계측법에 의해 핵을 분석 할 수 있습니다. 방법이 성공적으로 호중구 및 다른 세포 유형에서 핵으로 NF-κB와 엘크-1 핵 요소를 검색하는 데 사용되었습니다. 따라서,이 방법은 세포 유형의 다양한 절연 핵에서 전사 인자의 활성을 분석하기위한 옵션을 나타냅니다.
Introduction
호중구는 말초 혈 1의 가장 풍부한 백혈구 수 있습니다. 염증과 감염 호중구 동안 그들은 방어 2의 첫 번째 줄의 역할을 어디에 해당 사이트에 표시 할 수있는 최초의 세포입니다. 호중구는 phagocytosis, 반응성 산소 종의 생산, degranulation의 lytic 효소의 출시, 그리고 4,5 염증성 크린 시토 킨의 생산 등 여러 가지 항균 메커니즘 3 가지고 있습니다. 호중구는 빠른 속도로 다양한 세포 표면 수용체에서 신호를 통해 작동하게 수명이 짧은 세포입니다. 호중구는 자신의 짧은 수명으로 인해 터미널 셀을 고려하여 염증 과정을 여섯 동안 활성화하지 않는 한 그들은 apoptosis를 받아야하기 때문에, 그것은 그들은 또한 특정 유전자의 전사 수준을 변경하여 자신의 표현형을 수정할 수 있도록 지금 명확되어 있지만. 크린 시토 킨 5 apoptosis 7,8의 억제의 생산은 두있다,mportant 활성화에 의존적 세포 기능은 호중구의 전사 수준에서 조절. 원자력 요소 κB (NF-κB)는 시토 킨 생산 (4)의 전사 조절과 세포 생존과 다양한 세포 유형에 apoptosis 9-11의 규정에 참여하고 있습니다.
핵 인자 활성화로 이어질 신호 경로는 일반적으로 기자 유전자 assays 또는 전기 영동 이동의 assays (EMSA)에 의한 연구하고 있습니다. 호중구는 수명이 짧은 세포이기 때문에 호중구 transfection에 대한 효율적인 기술이 없으므로 다만,이 셀에 transcriptionally 규제 응답의 연구는, 기자 유전자 assays을 수행 할 수 없습니다. EMSA의 assays는 핵 인자 활성화 12,13을 둘러 호중구에 사용 된, 그 방사성 물질의 사용을 포함하기 때문에 그러나,이 방법은 복잡하고 비용이 있습니다. Nucleofection는 successfu 사용되었습니다 또 다른 방법입니다베드로 단핵 세포 14 transfect합니다. 따라서, 적어도 이론적으로는, 핵 인자 정품 인증 (낮은 효율에도 불구하고) transfection에 의해 호중구에서 감지 될 수 있습니다. 그러나,이 기술은 더 비싼 시간이 오래 걸릴뿐 아니라 아마도 덜 정량 것이다. immunostained 세포의 현미경 분석도 핵에 핵 요소를 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 사실, 우리는 핵이 방법 15로 NF-κB의 translocation를 발견했습니다. 불행하게도,이 기술은 또한 시간이 많이 걸리는 덜 양적, 그리고 관찰자의 편견에 따라 달라질 수 있습니다.
여기, 우리는 유동 세포 계측법에 의한 분리 및 immunolabeled 핵의 핵 요인의 감지 및 정량화 할 수있는 간단하고 효율적인 방법을 제시한다. 우리는 인간의 말초 혈액에서 호중구를 분리하는 기술을 설명, (F, 안티 – 수용체 항체와 integrins 또는 FC 수용체를 통해 이러한 세포를 자극 분리하고 immunolabel의 핵 및 유동 세포 계측법에 의해 핵을 분석igure 1). 방법이 성공적으로 NF-κB 15 호중구 핵의 엘크-1 16 핵 요소를 검색하는 데 사용되었습니다. 이 방법의 감도는 핵의 핵 요소 수준의 작은 변화를 감지 할 수 있습니다. 이 방법은 다른 세포 유형에서 핵에서 전사 인자의 수준을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 정화 방법은 짧은 시간에 95 % (현미경 관찰에 의해 평가)보다 큰 결함이있는 unstimulated 호중구의 분리 (PMN)를 할 수 있습니다. 후자가 완전히 lysed되지 않은 경우 때때로 호중구는 적혈구에 의해 오염 될 수 있습니다. 적혈구와 PMN 쉽게 유동 세포 계측법에 의해 서로 다른 세포 집단으로 구별 할 수 있기 때문에 이것은 보통, 기술에 영향을주지 않습니다. 절연 PMN 그런 다음 특정 단클?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 그녀의 기술 지원을 위해 낸시 모라 감사드립니다.
이 작품은 Consejo Nacional 드 Ciencia Y Tecnologia, 멕시코에서 연구 보조금 48,573-M과 168,098 의해 보조금 IN212308 및 IN205311-2 Direccion에서 일반 드 Asuntos 델 개인 Academico, Universidad Nacional Autonoma 드 멕시코, 멕시코에 의한 자금을 지원했다.
Materials
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Mexico) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S9390 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium chloride anhydrous | Sigma | M8266 | |
| DL-dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Trypan Blue (0.4 % solution) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Monoclonal antibody IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Human-specific anti-FcRII (CD32) |
| Monoclonal antibody 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Human-specific anti-FcRIII (CD16) |
| Monoclonal antibody TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donated by Dr. Martin Hemler | Human-specific anti-β1 integrin (CD29) |
| Monoclonal antibody IB4 | University of California, San Francisco | Donated by Dr. Eric J. Brown | Human-specific anti-β2 integrin (CD18) |
| F(ab’)2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Rabbit polyclonal antibody |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Centrifuge, Sorvall Tabletop | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-meter | Corning | 340 | |
| Pipetman pipette P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman pipette P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman pipette P-1000 | Gilson | F123602 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600 | |
| Inverted microscope | Nikon | TMS | |
| Water Bath Incubator | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414C | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Flow Cytometer | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur |
References
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