En enkel og effektiv metode for å oppdage kjernefysiske faktor Activation i Human Nøytrofile ved flowcytometri
Summary
Nøytrofiler er de mest tallrike leukocytter i blod. Nøytrofile har transkripsjonelt regulert funksjoner som produksjon av proinflammatoriske cytokiner og hemming av apoptose. Disse funksjonene kan studeres med metoden som presenteres her, som tillater påvisning og kvantifisering av kjernefysiske faktorer ved flowcytometri i isolerte kjerner
Abstract
Nøytrofiler er de mest tallrike leukocytter i perifert blod. Disse cellene er de første til å vises på nettsteder for betennelse og infeksjon, og ble dermed den første linjen i forsvaret mot invaderende mikroorganismer. Nøytrofiler besitter viktige antimikrobielle funksjoner som fagocytose, frigjøring av lytiske enzymer, og produksjon av reaktive oksygenarter. I tillegg til disse viktige forsvar funksjonene, nøytrofiler utføre andre oppgaver som respons på infeksjon, for eksempel produksjon av proinflammatoriske cytokiner og hemming av apoptose. Cytokiner rekruttere andre leukocytter som hjelper fjerne infeksjonen, og hemming av apoptose lar nøytrofile å leve lenger på stedet av infeksjon. Disse funksjonene er regulert på nivået av transkripsjon. Men fordi nøytrofiler er kortvarige cellene, kan studiet av transkripsjonelt regulert responser i disse celler ikke utføres med konvensjonelle rapportørgen metoder siden det er ingen effektivstrekkelig teknikker for nøytrofile transfeksjon. Her presenterer vi en enkel og effektiv metode som gjør det mulig påvisning og kvantifisering av kjernefysiske faktorer i isolert og immunolabeled kjerner med flowcytometri. Vi beskriver teknikker for å isolere rene nøytrofile granulocytter fra humant perifert blod, stimulere disse cellene med anti-reseptor-antistoffer, isolere og immunolabel atomkjerner, og analysere kjerner ved strømningscytometri. Metoden har blitt brukt til å påvise NF-κB og elg-1 kjernefysiske faktorer i kjerner fra nøytrofile og andre celletyper. Således representerer denne metoden et alternativ for å analysere aktivering av transkripsjonsfaktorer i isolert kjerner fra en rekke celletyper.
Introduction
Nøytrofile er de mest tallrike leukocytter i perifert blod en. Ved betennelse og infeksjon nøytrofile er de første cellene til å vises på den berørte området der de opptrer som den første linjen i forsvaret to. Nøytrofile har flere antimikrobielle mekanismer 3 inkludert fagocytose, produksjon av reaktive oksygenforbindelser, utgivelsen av lytiske enzymer ved degranulation, og produksjon av proinflammatoriske cytokiner 4,5. Nøytrofile er kortlivede celler som blir raskt aktiveres gjennom signalisering fra ulike celleoverflatereseptorer. Selv nøytrofile er vurdert terminal celler på grunn av deres korte levetid og fordi de gjennomgå apoptose mindre aktivert under den inflammatoriske prosessen 6, er det nå klart at de kan også endre deres fenotype ved å endre nivået av transkripsjon av bestemte gener. Produksjonen av cytokiner 5 og inhibering av apoptose 7,8 er to jegmportant aktivering-avhengige cellefunksjoner regulert på nivået av transkripsjon i nøytrofile. Nukleær faktor κB (NF-κB) deltar i den transkripsjonelle kontroll av cytokin produksjon 4 og i reguleringen av celleoverlevelse og apoptose 9-11 i ulike celletyper.
De signalveier som fører til kjernefysisk faktor aktivering er vanligvis studert av reporter genet analyser eller elektroforetiske mobilitet skift analyser (EMSA). Men fordi nøytrofiler er kortvarige cellene, kan studiet av transkripsjonelt regulert responser i disse cellene ikke utføres med rapportørgen assays, siden det er ingen effektiv teknikk for nøytrofil transfeksjon. EMSA assays har blitt brukt i nøytrofile å utforske kjernefysiske faktor aktivering 12,13, men er denne metodikken komplisert og dyrt fordi det innebærer bruk av radioaktivt materiale. Nucleofection er en annen teknikk som har blitt brukt successfully å transfektere monocytter 14. Dermed hvert fall i teorien, kunne kjernefysiske faktor aktivering påvises i nøytrofile etter transfeksjon (til tross for lav effektivitet). Men ville denne teknikken bli dyrere, tidkrevende og trolig mindre kvantitative. Mikroskopisk analyse av immunostained celler kan også brukes til å detektere kjernefysiske faktorer i kjernen. Faktisk har vi oppdaget NF-κB translokasjon inn i kjernen på denne måten 15. Dessverre er denne teknikken også tidkrevende, mindre kvantitative, og underlagt observatørens bias.
Her presenterer vi en enkel og effektiv metode som gjør det mulig påvisning og kvantifisering av kjernefysiske faktorer i isolert og immunolabeled kjerner med flowcytometri. Vi beskriver teknikker for å isolere nøytrofile granulocytter fra humant perifert blod, stimulere disse cellene via integriner eller FC reseptorer med anti-reseptor antistoffer, isolere og immunolabel kjerner, og analysere kjerner med flowcytometri (Figur 1). Metoden har blitt brukt til å påvise NF-κB 15 og elg-1 16 kjernefysiske faktorer i nøytrofile kjerner. Sensitiviteten av denne metoden tillater påvisning av små endringer i nukleære faktor nivåer i kjernen. Denne metoden kan også brukes til å analysere nivået av transkripsjonsfaktorer i kjerner fra andre celletyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rensemetoden beskrives her tillater isolering av ustimulert nøytrofiler (PMN) med renhet større enn 95% (vurdert ved mikroskopisk observasjon), i en kort tid. Iblant nøytrofiler kan være forurenset av erytrocytter dersom sistnevnte ikke lyseres helt. Dette påvirker vanligvis ikke teknikken, siden erytrocytter og PMN lett kan identifiseres som egne cellepopulasjoner ved flowcytometri. Isolert PMN kan deretter bli stimulert av tverrbindende bestemte reseptorer med spesifikke monoklonale antistoffer. Faktisk kan PMN o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Nancy Mora for henne teknisk assistanse.
Dette arbeidet ble finansiert av forskningsmidler 48573 M og 168 098 fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, Mexico, og med tilskudd IN212308 og IN205311-2 fra Direccion General de Asuntos del Personal Academico, Universidad Nacional Autónoma de Mexico, Mexico.
Materials
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Mexico) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S9390 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium chloride anhydrous | Sigma | M8266 | |
| DL-dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Trypan Blue (0.4 % solution) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Monoclonal antibody IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Human-specific anti-FcRII (CD32) |
| Monoclonal antibody 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Human-specific anti-FcRIII (CD16) |
| Monoclonal antibody TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donated by Dr. Martin Hemler | Human-specific anti-β1 integrin (CD29) |
| Monoclonal antibody IB4 | University of California, San Francisco | Donated by Dr. Eric J. Brown | Human-specific anti-β2 integrin (CD18) |
| F(ab’)2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Rabbit polyclonal antibody |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Centrifuge, Sorvall Tabletop | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-meter | Corning | 340 | |
| Pipetman pipette P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman pipette P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman pipette P-1000 | Gilson | F123602 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600 | |
| Inverted microscope | Nikon | TMS | |
| Water Bath Incubator | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414C | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Flow Cytometer | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur |
References
- Sendo, F., et al. Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response. Human Cell. 9, 215-222 (1996).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
- Naussef, W. M. How human neutrophils kill and degrade microbes. An integrated view. Immunol. Rev. 219, 88-102 (2007).
- Scapini, P., et al. The neutrophil as a cellular source of chemokines. Immunol. Rev. 177, 195-203 (2000).
- Hamilton, T., et al. Cell type- and stimulus-specific mechanisms for post-transcriptional control of neutrophil chemokine gene expression. J. Leukoc. Biol. 91, 377-383 (2012).
- Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol. Rev. 193, 101-110 (2003).
- Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Molecular control of neutrophil apoptosis. FEBS Lett. 487, 318-322 (2001).
- Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game. Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).
- Green, D. R. Death and NF-κB in T cell activation: life at the edge. Mol. Cell. 11, 551-552 (2003).
- Papa, S., Zazzeroni, F., Pham, C. G., Bubici, C., Franzoso, G. Linking JNK signaling to NF-κB: a key to survival. J. Cell Sci. 117, 5197-5208 (2004).
- Valente, P., et al. TNF increases camptothecin-induced apoptosis by inhibition of NF-κB. Eur. J. Cancer. 39, 1468-1477 (2003).
- Choi, M., et al. Inhibition of NF-κB by a TAT-NEMO-binding domain peptide accelerates constitutive apoptosis and abrogates LPS-delayed neutrophil apoptosis. Blood. 102, 2259-2267 (2003).
- Wang, K., et al. Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-κB signaling pathways. J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).
- Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).
- Garcia-Garcia, E., Rosales, C. Nuclear factor activation by FcγR in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method. J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. FcγRIIA and FcγRIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils. J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).
