Teknikker til visualisering retinal cytoarchitecture støder direkte op til de enkelte elektroder i en retinal stimulator.
Med den seneste udvikling af retinale proteser, er det vigtigt at udvikle pålidelige metoder til vurdering af sikkerheden af disse enheder i prækliniske studier. Men den standard fiksering, forberedelse, og automatiserede histologi procedurer er ikke ideel. Her beskriver vi nye procedurer for evaluering sundheden af nethinden støder direkte op til et implantat. Retinal proteser har elektrode arrays i kontakt med øjet. Tidligere metoder har ikke været i stand til rumligt lokalisere det okulære væv støder op til de enkelte elektroder i sættet. Hertil kommer, ofte standard histologiske behandling resulterer i grov kunstig frigørelse af retinale lag, når vurderer implanterede øjne. Derfor har det været vanskeligt at vurdere lokal skade, hvis til stede, forårsaget af implantation og stimulering af en implanteret elektrode array. Derfor har vi udviklet en metode til at identificere og lokalisere det okulære væv i nærheden implanteret electrodes ved hjælp af en (farve-kodet) farvestof mærkningsordning, og vi ændrede et øje fiksering teknik til at minimere kunstig nethindeløsning. Denne metode gengives også sclera gennemskinnelig, så lokalisering af individuelle elektroder og specifikke dele af et implantat. Endelig brugte vi et matchet kontrol for at øge styrken af de histopatologiske vurderinger. Sammenfattende giver denne metode pålidelig og effektiv diskrimination og vurdering af nethinden cytoarchitecture i en implanteret øje.
Retinale proteser kan snart blive nyttige kliniske tiltag til behandling af forskellige former for alvorlig synstab. Visse betingelser, såsom retinitis pigmentosa (RP), resulterer i den udbredte degenerering af fotoreceptorer i øjet, som er de celler, der er ansvarlige for at transducere lys i neurale signaler. Men nogle celler i andre lag af nethinden forblive og er potentielle mål for elektrisk stimulation med en retinal protese 1.. Tidlige resultater fra kliniske forsøg på mennesker har været lovende for elektrode arrays implanteret i Epiretinal 2,3, subretinal 4,5 og intrascleral 6 steder. Disse enheder er fremstillet af forskellige materialer med forskellige former, men de anvender alle elektriske impulser til at aktivere de resterende levedygtige neuroner i nethinden for at skabe visuelle perceptioner.
Vores bredere gruppe (Bionic Vision Australia) har udviklet en retinal implantat, der har gradvissed en klinisk pilotundersøgelse med 3 RP patienter implanteret med suprachoroidal elektrode arrays (Clinical Trial Nummer: NCT01603576). Figur 1A viser denne suprachoroidal prototype retinal protese.
Patientsikkerhed er altafgørende i kliniske studier, og dermed før de påbegynder menneskelige forsøg udførte vi en omfattende akut og kronisk test i prækliniske modeller (figur 1B). Histopatologiske vurderinger var afgørende at forfine de kirurgiske procedurer, gentage gennem elektrode design, og i sidste ende etablere sikkerheden af implantatet. For at opretholde en effektiv arbejdsgang afstemmes med standard klinisk patologi praksis blev en paraffinfiksering teknik anvendes. Det var også ønskeligt at anvende farvningsprocedurer sammenlignelige med kliniske standarder, såsom hæmatoxylin og eosin (H & E), som let fortolket af patologer. Vi ønskede også en teknik, der kan tilpasses til immunohistokemiske analyser, iFor at lette yderligere cellulær evaluering af væv.
Biokompatibilitet af implantat materialer, og sikkerheden for kronisk elektrisk stimulation, skal vurderes nøje. Det er vigtigt at være i stand til at undersøge histopatologi det okulære væv støder op til de enkelte stimulerende elektroder i sættet. Imidlertid opstillingerne skulle fjernes før behandling af prøverne, så de kan testes, og fordi deres metalliske komponenter ikke kunne være let snit. Følgelig har vores etablerede væv forberedelse ikke tillade lokalisering og kortlægning af væv med hensyn til de implanterede elektroder 7. Ud over manglen på en vævslokalisering metode resulterede standard formaldehyd-baserede fiksering og forarbejdningsteknikker i udbredte artefakter og frigørelse af den retinale grund af den forskellige krympning af de forskellige lag i øjet (fig. 2). På grund af manglende homogenitet af than nethinden, var det vanskeligt at foretage valide sammenligninger med styring væv, især for kvantitative målinger. Disse kombinerede begrænsninger komplicerede præcise vurderinger af den potentielle skade forårsaget af vores implanterede arrays.
Her præsenterer vi nye teknikker til at overvinde disse begrænsninger. Vi har ændret specialiserede øje fiksering og behandling teknikker 8-10 for at opretholde kompatibilitet med paraffin-baserede histologi. Vi har ændret standard histologiske og immunhistokemiske pletter til at give sammenlignelige resultater, baseret på feedback fra kliniske patologer. Efter gøre den sclerale væv gennemskinnelige blev en farvestofbaseret farvekode ansat til at markere øjenvævet støder op til hver enkelt elektrode, før du fjerner array fra suprachoroidal rum. Ved at markere elektrode array og de individuelle elektrodesteder kunne prøverne præcist indsamles fra elektrode tilstødende regioner. Matchede prøver kunne indhentes fra the kontrol øje for at lette parvise sammenligninger.
Vurdere sikkerheden af implantatet er en primær overvejelse for prækliniske studier. Før et retinal protese kan implanteres i mennesker er det vigtigt at kontrollere, at det ikke vil forårsage nogen skade. Dette kræver en vurdering af både implantatet biokompatibilitet 17-23 samt eventuelle potentielle skader, der kan være forårsaget af kronisk elektrisk stimulation 24-26. Erfaringerne med lignende neurale proteser, såsom cochlear implant, giver et indblik i den brede vifte af stimulation, og fysisk, parametre, der ikke forårsager vævsskader 27. Men nethinden har forskellige egenskaber til andre implantationssteder, og derfor præcise sikkerhedsfaktorer grænser (såsom maksimalt ladningstæthed) kan ikke antages fra tidligere undersøgelser i andre systemer. Ladningsdensiteter er højest på den aktive elektrode sites, og dette svarer til det største potentiale for skader. Derfor en fremgangsmåde til at lokalisere væv direkte tilstødendede enkelte aktive elektroder ville i høj grad øge anvendeligheden af disse undersøgelser. Vævet støder op til bestemte områder af implantatet kan også fremhæves for nærmere inspektion. Denne målrettede tilgang tillader færre sektioner, der skal analyseres, og samtidig bevare tilliden til, at "worst case scenario" blev undersøgt.
Den sclera farvestof lokalisering her beskrevne er blevet grundigt testet med hånd-formet og støbt silicone / Pt-elektrode arrays 28-30. Det har været brugt med tynd-film polyamid arrays 7,31 og også tynd-film silikone / Pt arrays 32. Nogle retinale protese undersøgelser beskæftiget "bullet formet" elektroder med intrascleral implantationer 33.. Den foreliggende teknik bør være effektive til at vurdere denne type elektrode arrays. Feline øjnene med tynd sclera (tykkelse ved bageste stang 90-200 um) tilladt visualisering af de enkelte elektroder i et array. Men selv om individuel elektrodes var ikke synlige, deres positioner let kan udledes ved hjælp af en silikone skabelon, når omridset af array kan ses (svarende til den, der anvendes i trin 2.6).
Farvestoffet kortlægning begrænser behovet for at opnå ikke-relevante vævssektioner da kun sektioner med farvestoffet øjeblikket opnås. Evnen til præcist at udlede elektrode position ikke kun giver mulighed relevante histopatologiske analyse og større statistisk styrke, men har en stor indflydelse på tid og omkostninger med at reducere mængden af dias og klinger anvendes, såvel som prisen på arbejdskraft. Brugen af farvestof, der er holdbar og kan modstå vævsbehandlingen samtidig også synlig i ufarvede vævssnit er et vigtigt indledende overvejelse. Kendskab til placering af farvestoffet og orienteringen af vævet ved dissektion og under indlejring bistår opskæringen. Dette omfatter korrekt orientere blokken for at opnå en sektion, der ikke skåret skråt og giver en fuld representatipå af vævet. Det er derfor vigtigt, at den person, der udfører skæringen er til stede på tidspunktet for farvestoffet ansøgning, dissektion og forankring.
Den overordnede protokol er robust over for mindre ændring, især med fiksering tider. Men øjet dissektion og farvestof mærkning skridt er hårfine procedurer, der nyder godt god håndelag for at undgå at beskadige prøven. Mens Davidson fixativ har vist sig effektiv til at reducere kunstig nethindeløsning nær et implantat, er det ikke forhindre direkte mekaniske skader under dissektion. Davidson fiksativ var ikke umiddelbart foreneligt med nogle specielle histologiske og immunhistokemiske procedurer. Derfor var der behov for at ændre / optimere disse trin som beskrevet ovenfor. Trinvise ændringer i farvning tider og koncentrationer blev foretaget indtil den optimale resultat blev opnået – for flere detaljer til de supplerende materiale henvises.
Kvantificering af retinalhistologi fortsat problematisk. Nethinden er uensartet, og både tykkelsen og celledensiteten forandring med stigende afstand fra området centralis 34,35. Derfor kan tilstødende væv i det implanterede øje ikke anvendes til sammenligninger og en kontrol øje anvendes i stedet. Parvis matching af hvert afsnit med kontrol-eye giver os en mere kraftfuld statistisk sammenligning af patologiske forandringer, effekt og sikkerhed resultater med retinale proteser er bedre vurderes når man sammenligner de kolleger øjne i et emne 36. Særlig forsigtighed skal udvises for at minimere skrå skæring, da dette vil påvirke kvantificering.
Sammenfattende beskrev de metoder ovenfor, har væsentligt forbedret vores histopatologisk analyse, hvilket igen har ført til en mere effektiv præklinisk workflow. Resultaterne af prækliniske studier med disse metoder direkte førte til et klinisk forsøg, hvor 3 RP patienter er blevet sikkert implanteret med suprachoroidal retinale proteser. Disse metoder er relevante for både de retinale stimulatorer og andre okulære implantater, hvor den patologiske reaktion på lang sigt implantation skal evalueres. Denne metode forudsat værdifulde fordele for at opretholde cytoarchitecture og registrering af patologi til områder af interesse på implantatet. Skønt det ikke specifikt testes, kan en ændring af disse procedurer anvendes i andre arter og andre anatomiske steder, navnlig når en matrix er implanteret overfladisk.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke: Ms Alexia Saunders og Ms Michelle McPhedran til eksperimentel bistand Ms Helen Feng for elektrode fabrikation, Dr. Penny Allen og Dr. Jonathan Yeoh til kirurgisk bistand Staff af Royal Victorian øjet og øret Hospital Biologisk Forskningscenter for dyrevelfærd; Prof. Rob Shepherd for generel vejledning i hele, og Dr. Bryony Nayagam og Mr. Ronald Leung til kritiske bemærkninger til et udkast af manuskriptet.
Dette arbejde blev udført på Bionics Institute og St. Vincent Hospital, Melbourne. Finansieringen blev leveret af Ian Potter Foundation, John T Reid Charitable Trusts, og det australske forskningsråd gennem sin særlige Research Initiative i Bionic Vision Science and Technology tilskud til Bionic Vision Australia (BVA). Den Bionics Instituttet anerkender den støtte, den modtager fra den victorianske regering gennem sin operationelle infrastruktur Support Program.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
The Davidson marking system | Bradley Products | 1163-4 – red 1163-5 – blue 1163-2 – yellow 1163-1- green | |
Rabbit Polyclonal Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Millipore | AB5804 | 1:1500, overnight incubation |
Mouse Monoclonal Anti-Glutamine Synthetase Antibody | Millipore | MAB302 | 1:100 overnight incubation |
Monoclonal Mouse Anti-Neurofilament 200 Antibody | Sigma-Aldrich | N0142 | 1:100 overnight incubation |
4',6-diamindino-2-phenylindole, dilactate (dilactate) | Life Technologies | D3571 | 1:25,000 30 min incubation |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | 1:500 |
Superfrost 90° yellow | Grale Scientific | SF41299 | |
FLEX IHC Microscope Slides | DAKO | K802021-2 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | 1:500 |
Normal goat serum | Life Technologies | PCN5000 | 10% serum/0.1% Triton X-100/PBS |
Non-Standard Solution Preparation for Special Stains 1% Aqueous Cresyl Violet Stock Solution
Cresyl Violet Acetate Working Solution
Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution
Phosphomolybdic-Phosphtungstic Acid Solution
Aniline Blue Solution
Solutions for Immunohistochemistry Wash Buffer Solution
Serum Block Solution
SUPPLEMENTARY MATERIAL Luxol Fast Blue The purpose of performing a Luxol Fast Blue (LFB) stain was to identify the ganglion cells in the ganglion cell layer through the counterstain of cresyl violet. While LFB stains myelin, the cresyl violet stain binds to the Nissl substances in neurons, composed of rough endoplasmic reticulum and ribosomes. Numerous cells in the retina contain Nissl substance including amacrine cells. These cells usually are located in the inner boundary layer of the inner nuclear layer, but displaced amacrine cells can be found in the ganglion cell layer. The staining of Nissl substance is helpful in differentiating large, heavily stained ganglion cells from smaller displaced amacrine cells. To aid visualisation of these cells, we modified the cresyl violet working solution protocol by increasing the volume of the cresyl violet stock solution in the working solution. We increased the volume in 1.0 ml increments from 6.0 ml to 9.0 ml, in turn reducing the volume of distilled water. Assessing the ease of visualising and identifying the ganglion cells, optimal staining was achieved with 9 ml of additional cresyl violet stock solution and 51 ml of distilled water. Cresyl violet is a basic dye, though to dye the Nissl substance, it is required to be used in an acidic solution, and therefore the volume of acetic acid remained unchanged at 0.5 ml. Periodic Acid Schiff The Periodic Acid Schiff (PAS) stain was performed to highlight polysaccharides especially glycogen, found in basement membranes and fungal cell walls, indicating a fungal infection. The process of the PAS stain is to oxidise the hydroxyl groups in polysaccharides using periodic acid, producing aldehyde groups. The application of the Schiff reagent, binds to the aldehyde groups producing a magenta color with haematoxylin counterstaining producing purple cell nuclei. Our slides showed weak staining at the inner limiting membrane. This may be due to the polysaccharides present, as not all polysaccharides can be oxidised with a standard time frame, especially those containing anionic polysaccharides. We therefore increased the duration of the oxidation step from 10 min to 12, 15, and 20 min. We found that a 15 min oxidation step was most effective in PAS staining. Masson’s Trichrome Blue The principle of the Masson's trichrome blue stain is to stain collagen and muscle, which in our retinal slides can be used to indicate an increase in collagen tissue which may indicate fibrosis due to injury. This stain is sensitive to fixation techniques, so alterations were needed to obtain optimal staining. The process of this stain is to initially stain cytoplasm and muscle fibres red using the acidic Biebrich scarlet-acid fuchsin red dye. Differentiation with phosphomolybdic/phosphotungstic acid competes with the red dye in the collagen fibres. In the sclera, the large phosphomolybdic/phosphotungstic acid molecules are able to penetrate the loose connective tissue, as opposed to the dense muscle fibres which are penetrable to small molecules only. Aniline blue dye is then applied to replace the acid in the collagen fibres producing blue dyed sclera. To optimise this stain in retinal sections, the duration of staining with Biebrich scarlet-acid fuchsin dye was reduced to create a balance between the blue and the red dye. The use of Davidson's fixative also required an extended differentiation time to remove the red dye from the collagen. We trialled differentiation at 5, 6, 8, and 10 min, with optimal results occurring at 6 min. Differentiation also varies on the thickness and cutting of smooth sections, with greater than 6 min differentiation possibly being required. Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody Polyclonal, host species is rabbit, has a molecular weight of 50 kDa. GFAP antigen is an intermediate filament found in the cytoplasm (the cytoplasm of astrocytes and Müller cells in the retina), the antigen is made form 428 amino acids and has a molecular weight of 49512 Da. Neurofilament-200 antibody Monoclonal, host species is mouse, clone N52, isotype IgG1, it recognises phosphorylated and non-phosphorylated forms of the heavy neurofilaments which have a molecular weight of 200 kDa. The antibody will bind to an epitope in the tail domain of the neurofilament. The antibody will stain neurofilaments in the neuronal perikarya, dendrites and axons. Glutamine Synthetase (GS) antibody Monoclonal, clone GS-6, host species is mouse, has a molecular weight of 45 kDa and antibody isotype IgG2a. The GS antigen is found in the cell cytoplasm (cytoplasm of Müller cells in the retina), the antigen has 373 amino acids and a molecular weight of 42,064 Da. |