Tekniker för att visualisera näthinnan cytoarchitecture direkt anslutning till enskilda elektroder inom en retinal stimulator.
Med den senaste utvecklingen av retinal proteser, är det viktigt att utveckla tillförlitliga metoder för att bedöma säkerheten av dessa apparater i prekliniska studier. Men standarden fixering, förberedelser, och automatiserade rutiner histologi är inte idealisk. Här beskriver vi nya rutiner för utvärdering av vård av näthinnan i direkt anslutning till ett implantat. Retinal proteser har elektrodfält i kontakt med ögat vävnad. Tidigare metoder har inte kunnat att rumsligt lokalisera den okulära vävnaden intill individuella elektroderna inom arrayen. Dessutom resulterar standard histologisk bearbetning ofta i grov artefaktuella avskiljandet av retinaskikt vid bedömning implanterade ögon. Följaktligen har det varit svårt att bedöma lokala skador, om närvarande, som orsakas av implantation och stimulering av en implanterad elektrod array. Därför utvecklade vi en metod för att identifiera och lokalisera den okulära vävnaden intill implanterad electrodes använder en (färgkodade) färgämne märkning system, och vi ändrat ett teknik ögonfixation att minimera artefaktuella näthinneavlossning. Denna metod gjorde också sklera genomskinlig, vilket möjliggör lokalisering av enskilda elektroder och specifika delar av ett implantat. Slutligen använde vi en matchad kontrollgrupp för att öka kraften i de histopatologiska bedömningar. Sammanfattningsvis tillåter denna metod pålitlig och effektiv diskriminering och bedömning av den retinal cytoarchitecture i ett implanterat öga.
Retinal proteser kan snart bli användbara kliniska interventioner för att behandla olika former av svår synnedsättning. Vissa villkor, såsom retinitis pigmentosa (RP), resulterar i utbredd degeneration av fotoreceptorer i ögat, som är de celler som ansvarar för att omvandla ljus till neurala signaler. Men vissa celler i andra skikt i näthinnan kvarstår och är potentiella mål för elektrisk stimulering med en retinal protes 1. Tidiga resultat från kliniska prövningar har varit lovande för elektrodfält implanteras i epiretinal 2,3, subretinal 4,5 och intrascleral 6 platser. Dessa anordningar är gjorda av olika material med olika former, men använder sig alla elektriska pulser för att aktivera de återstående viabla neuroner i näthinnan för att skapa visuella percepts.
Vår större grupp (Bionic Vision Australien) har utvecklat en retinal implantat som har successivtsed att en klinisk pilotstudie med 3 RP patienter implanterade med suprakoroidala elektrodanordningar (Clinical Trial Number: NCT01603576). Figur 1A visar denna suprakoroidala prototyp retinal protes.
Patientsäkerheten är av största vikt i kliniska studier och därmed, innan försök på människa, utförde vi omfattande akut och kronisk testning i prekliniska modeller (Figur 1B). Histopatologiska bedömningar var nödvändiga för att förfina kirurgiska ingrepp, iterera genom elektroden konstruktion, och slutligen fastställa implantatets säkerhet. För att upprätthålla ett effektivt arbetsflöde samordnas med vanliga kliniska patologi övar, var en paraffininbäddning teknik som används. Det var också önskvärt att utnyttja färgningsförfaranden jämförbara med kliniska normer, såsom hematoxylin och eosin (H & E), som lätt tolkas av patologer. Vi ville också ha en teknik som kunde anpassas för immunhistokemisk analys, iför att underlätta ytterligare cellulär utvärdering av vävnaderna.
Biokompatibiliteten av implantatet material, och säkerheten av kronisk elektrisk stimulering, måste bedömas noggrant. Det är viktigt att kunna undersöka histopatologi av den okulära vävnaden intill de individuella stimulerande elektroder inom arrayen. Emellertid arrayema behövde avlägsnas före bearbeta prover så att de kan testas, och eftersom deras metalliska komponenter inte kunde vara lätt sektioneras. Följaktligen gjorde vår etablerade vävnad förberedelse tillåter inte lokalisering och kartläggning av vävnad med avseende på de implanterade elektroderna 7. Förutom avsaknaden av en vävnadslokalisering metod resulterade standard formaldehyd-baserade fixering och bearbetningstekniker till omfattande artefakter och avlossning av näthinnan på grund av olika krympning av de olika skikten i ögat (fig. 2). På grund av den icke-homogenitet hos than näthinnan, var det svårt att göra meningsfulla jämförelser med kontroll vävnad, särskilt för kvantitativa mätningar. Dessa kombinerade begränsningar komplicerade korrekta bedömningar av de potentiella skador som orsakats av våra implanterade arrayer.
Här presenterar vi nya tekniker för att övervinna dessa begränsningar. Vi har modifierat specialiserade ögonfixation och bearbetning tekniker 8-10 för att bibehålla kompatibilitet med paraffin-baserad histologi. Vi har modifierat vanliga histologiska och immunohistochemical fläckar att ge jämförbara resultat, baseras på feedback från kliniska patologer. Efter gör det senhinnan genomskinliga, var en dye-baserade färg-kod används för att markera den okulära vävnaden intill varje enskild elektrod, innan du tar bort arrayen från suprakoroidala rymden. Genom att markera elektroduppsättningen och enskilda webbplatser elektrod, kan proverna noggrant in från elektroden angränsande regioner. Matchade prov kan hämtas från the kontroll ögat för att underlätta parvisa jämförelser.
Säkerhetsbedömning av implantatet är en primär fråga för prekliniska studier. Innan en retinal protes kan implanteras i människor är det viktigt att kontrollera att det inte kommer att orsaka någon skada. Detta kräver en bedömning av både implantatets biokompatibilitet 17-23 samt eventuella skador som kan orsakas av kronisk elektrisk stimulering 24-26. Erfarenheter av liknande neurala proteser, till exempel cochleaimplantat, ger en inblick i det breda utbudet av stimulans, och fysiska, parametrar som inte orsakar vävnadsskada 27. Dock har näthinnan olika egenskaper till andra implantationsställen och därför exakta gränser säkerhet (t.ex. maxtaxan densitet) kan inte utgå från tidigare studier i andra system. Laddningstätheter är högst vid den aktiva elektroden platser och detta motsvarar den största risken för skador. Därför är en metod för lokalisering av vävnaden direkt anslutningtill de enskilda aktiva elektroderna skulle kraftigt öka användbarheten av dessa studier. Vävnaden intill specifika regioner av implantatet kan också lyftas fram för närmare granskning. Denna målinriktade metod tillåter färre sektioner som skall analyseras, samtidigt som de behåller förtroendet att "worst case scenario" undersöktes.
Den sklerala färgämne lokalisering här beskrivna metoden har testats med hand-formad och gjuten silikon / Pt arrayer elektrod 28-30. Det har använts med tunnfilms-polyamid arrayer 7,31 och även tunnfilms-silikon / Pt arrayer 32. Vissa retinal protes studier anställd "bullet formade" elektroder med intrascleral inplantera 33. Föreliggande teknik bör vara effektiva för att bedöma denna typ av elektrodgrupperna. Feline ögon med tunna sklera (tjocklek vid bakre stolpen 90 – 200 um) tillät visualisering av enskilda elektroder i en array. Men, även om enskilda elektrodes inte syntes, deras positioner lätt kan utläsas med hjälp av en silikon mall när konturen av arrayen kan ses (liknande den som användes i steg 2.6).
Färgämnet kartläggning begränsar behovet att få icke-relevanta vävnadssnitt som endast delar med dyegåvan erhålles. Förmågan att exakt härleda elektrod ställning inte bara tillåter relevanta histopatologisk analys och större statistisk, men har en stor inverkan på tid och kostnadskontroll genom att minska mängden av diabilder och blad används samt kostnaden för arbetskraft. Användningen av färgämne som är vidhäftande och tål vävnadsbehandling samtidigt också vara synlig i ofärgade vävnadssnitt är ett viktigt första övervägande. Kännedom om placering av färgämnet och orienteringen av vävnaden vid dissekering och under inbäddning bistår styckningen. Detta inkluderar korrekt orientering av blocket för att uppnå ett avsnitt som inte är snett skuren och ger en fullständig representatipå av vävnaden. Det är därför viktigt att den person som utför styckning är närvarande vid tidpunkten för färgämnet ansökan, dissektion och inbäddning.
Det övergripande protokollet är robust mot mindre ändringar, särskilt med fixering timings. Men ögat dissektion och färgämnet märkning stegen är komplicerade förfaranden som gynnas av god fingerfärdighet för att undvika skador på provet. Medan Davidsons fixativ har visat sig vara effektiv för att minska artefaktuella avlossning av näthinnan nära ett implantat, hindrar det inte direkta mekaniska skador under dissekering. Davidsons fixativ var inte lätt kan förenas med vissa särskilda histologiska och immunohistokemiska procedurer. Därför fanns det ett behov av att ändra / optimera dessa steg enligt ovan. Stegvisa förändringar i färgning tider och koncentrationer gjordes förrän den optimala resultatet uppnåddes – för mer information, hänvisas till kompletterande material.
Kvantifiering av retinalhistologi fortfarande problematiskt. Näthinnan är icke-homogen och både tjocklek och celltätheten förändras med ökande avstånd från området centralis 34,35. Därför kan angränsande vävnad inom den implanterade ögat inte användas för jämförelser och en kontroll öga används i stället. Parvis matchning av varje avsnitt med kontroll ögat ger oss en mer kraftfull statistisk jämförelse av patologiska förändringar, effekt och säkerhet utfall med retinal protetik är bättre bedömas när man jämför de andra ögon i ett ämne 36. Särskild försiktighet måste vidtas för att minimera sned skärning, eftersom detta skulle påverka kvantifiering.
Sammanfattningsvis beskrivs metoderna ovan har avsevärt förbättrat vår histopatologisk analys, vilket i sin tur har lett till en mer effektiv preklinisk arbetsflöde. Resultat från prekliniska studier med dessa metoder ledde direkt till en klinisk prövning i vilken 3 RP patienter har säkert implanteras med suprachoroidal retinala proteser. Dessa metoder är relevanta både för retinal stimulatorer och andra implantat okulära där det patologiska svaret på lång sikt implantation måste utvärderas. Denna metod som värdefulla fördelar för att upprätthålla cytoarchitecture och registrering av patologin till områden av intresse på implantatet. Även om inte specifikt testat, kan en ändring av dessa förfaranden användas i andra arter och andra anatomiska platser, särskilt när en matris implanteras ytligt.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka: Ms Alexia Saunders och Ms Michelle McPhedran för experimentell bistånd, Ms Helen Feng för elektrod tillverkning, Dr Penny Allen och dr Jonathan Yeoh för kirurgisk hjälp, personal på Royal Victorian öga och öra Hospital biologiska forskningscentret för djurvård, professor Rob Shepherd för allmän vägledning, och Dr Bryony Nayagam och Mr Ronald Leung för kritiska synpunkter på ett utkast av manuskriptet.
Detta arbete utfördes vid Bionik Institute och St Vincents Hospital, Melbourne. Finansiering gavs av Ian Potter Foundation, den John T Reid Charitable Trusts, och Australian Research Council genom sin särskilda Research Initiative i Bionic Vision Science and Technology bidrag till Bionic Vision Australien (BVA). Den Bionik Institute erkänner det stöd den får från den viktorianska regeringen genom sitt operativa Infrastruktur Support Program.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
The Davidson marking system | Bradley Products | 1163-4 – red 1163-5 – blue 1163-2 – yellow 1163-1- green | |
Rabbit Polyclonal Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Millipore | AB5804 | 1:1500, overnight incubation |
Mouse Monoclonal Anti-Glutamine Synthetase Antibody | Millipore | MAB302 | 1:100 overnight incubation |
Monoclonal Mouse Anti-Neurofilament 200 Antibody | Sigma-Aldrich | N0142 | 1:100 overnight incubation |
4',6-diamindino-2-phenylindole, dilactate (dilactate) | Life Technologies | D3571 | 1:25,000 30 min incubation |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | 1:500 |
Superfrost 90° yellow | Grale Scientific | SF41299 | |
FLEX IHC Microscope Slides | DAKO | K802021-2 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | 1:500 |
Normal goat serum | Life Technologies | PCN5000 | 10% serum/0.1% Triton X-100/PBS |
Non-Standard Solution Preparation for Special Stains 1% Aqueous Cresyl Violet Stock Solution
Cresyl Violet Acetate Working Solution
Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution
Phosphomolybdic-Phosphtungstic Acid Solution
Aniline Blue Solution
Solutions for Immunohistochemistry Wash Buffer Solution
Serum Block Solution
SUPPLEMENTARY MATERIAL Luxol Fast Blue The purpose of performing a Luxol Fast Blue (LFB) stain was to identify the ganglion cells in the ganglion cell layer through the counterstain of cresyl violet. While LFB stains myelin, the cresyl violet stain binds to the Nissl substances in neurons, composed of rough endoplasmic reticulum and ribosomes. Numerous cells in the retina contain Nissl substance including amacrine cells. These cells usually are located in the inner boundary layer of the inner nuclear layer, but displaced amacrine cells can be found in the ganglion cell layer. The staining of Nissl substance is helpful in differentiating large, heavily stained ganglion cells from smaller displaced amacrine cells. To aid visualisation of these cells, we modified the cresyl violet working solution protocol by increasing the volume of the cresyl violet stock solution in the working solution. We increased the volume in 1.0 ml increments from 6.0 ml to 9.0 ml, in turn reducing the volume of distilled water. Assessing the ease of visualising and identifying the ganglion cells, optimal staining was achieved with 9 ml of additional cresyl violet stock solution and 51 ml of distilled water. Cresyl violet is a basic dye, though to dye the Nissl substance, it is required to be used in an acidic solution, and therefore the volume of acetic acid remained unchanged at 0.5 ml. Periodic Acid Schiff The Periodic Acid Schiff (PAS) stain was performed to highlight polysaccharides especially glycogen, found in basement membranes and fungal cell walls, indicating a fungal infection. The process of the PAS stain is to oxidise the hydroxyl groups in polysaccharides using periodic acid, producing aldehyde groups. The application of the Schiff reagent, binds to the aldehyde groups producing a magenta color with haematoxylin counterstaining producing purple cell nuclei. Our slides showed weak staining at the inner limiting membrane. This may be due to the polysaccharides present, as not all polysaccharides can be oxidised with a standard time frame, especially those containing anionic polysaccharides. We therefore increased the duration of the oxidation step from 10 min to 12, 15, and 20 min. We found that a 15 min oxidation step was most effective in PAS staining. Masson’s Trichrome Blue The principle of the Masson's trichrome blue stain is to stain collagen and muscle, which in our retinal slides can be used to indicate an increase in collagen tissue which may indicate fibrosis due to injury. This stain is sensitive to fixation techniques, so alterations were needed to obtain optimal staining. The process of this stain is to initially stain cytoplasm and muscle fibres red using the acidic Biebrich scarlet-acid fuchsin red dye. Differentiation with phosphomolybdic/phosphotungstic acid competes with the red dye in the collagen fibres. In the sclera, the large phosphomolybdic/phosphotungstic acid molecules are able to penetrate the loose connective tissue, as opposed to the dense muscle fibres which are penetrable to small molecules only. Aniline blue dye is then applied to replace the acid in the collagen fibres producing blue dyed sclera. To optimise this stain in retinal sections, the duration of staining with Biebrich scarlet-acid fuchsin dye was reduced to create a balance between the blue and the red dye. The use of Davidson's fixative also required an extended differentiation time to remove the red dye from the collagen. We trialled differentiation at 5, 6, 8, and 10 min, with optimal results occurring at 6 min. Differentiation also varies on the thickness and cutting of smooth sections, with greater than 6 min differentiation possibly being required. Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody Polyclonal, host species is rabbit, has a molecular weight of 50 kDa. GFAP antigen is an intermediate filament found in the cytoplasm (the cytoplasm of astrocytes and Müller cells in the retina), the antigen is made form 428 amino acids and has a molecular weight of 49512 Da. Neurofilament-200 antibody Monoclonal, host species is mouse, clone N52, isotype IgG1, it recognises phosphorylated and non-phosphorylated forms of the heavy neurofilaments which have a molecular weight of 200 kDa. The antibody will bind to an epitope in the tail domain of the neurofilament. The antibody will stain neurofilaments in the neuronal perikarya, dendrites and axons. Glutamine Synthetase (GS) antibody Monoclonal, clone GS-6, host species is mouse, has a molecular weight of 45 kDa and antibody isotype IgG2a. The GS antigen is found in the cell cytoplasm (cytoplasm of Müller cells in the retina), the antigen has 373 amino acids and a molecular weight of 42,064 Da. |