Genetische Manipulatie van de muis Ontwikkelen Hypothalamus via<em> In utero</em> Elektroporatie
Summary
Ondanks de functionele en medische belang van de hypothalamus,<em> In de baarmoeder</em> Genetische manipulatie van zijn ontwikkeling is zelden geprobeerd. We tonen een gedetailleerde procedure voor<em> In de baarmoeder</em> Elektroporatie in de muis hypothalamus en tonen representatieve resultaten van de gedeeltelijke of volledige (regionale) hypothalamus transfectie.
Abstract
Genetische modificatie van specifieke gebieden van de ontwikkelende hersenen van zoogdieren is een zeer krachtige experimentele benadering. Echter, het genereren van nieuwe muismutanten is vaak frustrerend traag. Er is aangetoond dat de toegang tot de hersenen van muizen ontwikkelen in utero met redelijke post-operatory overleving mogelijk. Toch resultaten met deze procedure zijn bijna uitsluitend gerapporteerd voor de meest oppervlakkige en gemakkelijk toegankelijk deel van de ontwikkeling van de hersenen, dat wil zeggen de cortex. De thalamus, een smaller en middengebied is moeilijker doel gebleken. Transfectie in diepere kernen, met name die van de hypothalamus, is misschien wel de meest uitdagende en dus zeer weinig resultaten zijn gemeld. Hier laten we een procedure om de gehele hypothalamus neuroepithelium of deel daarvan (hypothalamische regio) voor transfectie door elektroporatie richten. De sleutels van onze aanpak zijn langer narcose keer, injectie in de third ventrikel en passende vorm en plaatsing van de elektroden. Daarnaast tonen we de resultaten van targeting en daaropvolgende histologische analyse van de meest verzonken hypothalamus nucleus, het mammillary lichaam.
Introduction
Genetische manipulatie van de embryonale hersenen van muizen is een geprefereerde aanpak te leren over ontwikkelingsregulatie. De generatie van mutante muizenlijnen echter traag en duur. Een methode wel specifieke genetische veranderingen in ontwikkeling neuronen van de hersenen van zoogdieren introduceren in utero elektroporatie. In wezen de techniek bestaat het transfecteren DNA in de embryonale hersenen neuroepithelium door middel van elektrische pulsen, waarna men het embryo te overleven gedurende een bepaalde tijd, het verzamelen van de hersenen en onderzoek ze mogelijke nieuwe, informatief fenotypes. Hierdoor kan de experimentator vrijwel direct testen hypotheses zonder lange wachttijden voor het samenstellen van muismutanten.
Transfectie van DNA in ontwikkelende embryo's begonnen met in-ovo elektroporatie op kippenembryo's 1. De essentiële proof-of-concept voor de muis werd uitgevoerd in de cultuur <sup> 2. Dit werd al snel gevolgd door de eerste beschrijvingen van de techniek op de muis in de baarmoeder 3,4.
Het belangrijkste probleem is de hersenen van embryo ontwikkeling in utero transfecteren zonder hen of moeder doden. Leren om de noodzakelijke operatie uit te voeren (laparotomie, injectie, elektroporatie) vereist een lange trainingsperiode. Zodra de operatie is de knie tot het punt waar de embryo overleving verhouding aanvaardbaar is, de volgende belangrijke vraag is: welke hersenstructuren toegankelijk zijn? Niet verrassend, de eerste gepubliceerde artikelen tonen de resultaten verkregen met in utero elektroporatie gericht op de corticale ontwikkeling 5-9. Dit is nog steeds geldt voor de meeste publicaties met deze techniek, omdat het gebied van de ontwikkeling van muizenhersenen meest toegankelijke chirurgische procedures is de cortex (Figuur 1). De procedure in utero elektroporatie in de cortex is beschrevenin print 10 en in video 11-14. Een modificatie van de techniek kan worden gebruikt om een ventrale deel van de grote hersenen, de basale ganglia 15 richten.
Voorbij de grote hersenen, het diencephalon (klassiek verdeeld thalamus en hypothalamus) is een gebied van de voorhersenen moeilijker bereikbaar. Een klein aantal papers meldingen targeting van haar rug en meest toegankelijke deel, de thalamus 16-19.
De hypothalamus is het ventrale deel van de voorhersenen, daarom een gelokaliseerde diepste van het dorsale oppervlak (cortex) (figuur 1). Deze regio blijft een moeilijke uitdaging voor onderzoekers verbonden aan genetisch manipuleren van de hersenen van muizen in de baarmoeder. Voor zover wij weten, melden slechts zeer weinig artikelen over de resultaten van de in utero transfectie in de muis hypothalamus 20,21. De functionele betekenis van de hypothalamus cannot worden overdreven, omdat het reguleert gedrag zoals eten en drinken, paring, fokken en opvoeden 22. Bovendien, veranderingen in hypothalamus ontwikkeling helpen de latere leeftijd aandoeningen zoals zwaarlijvigheid, hypertensie, diabetes en voortijdige puberteit 23 ontstaan. In staat zijn om genetisch veranderen de hypothalamus tijdens de ontwikkeling zou zorgen voor een zeer krachtig instrument om het te begrijpen.
De basis chirurgische protocol voor laparotomie zwangere muizen die we hier gebruikt is vergelijkbaar met die in andere protocollen 11,13,14,24. We zullen ze hier kort beschrijven op volledigheid. Sleutel tot onze procedure, anderzijds, zijn de vorm van anesthesie, de plaats van toediening, de aard van de elektroden en de insertie en de positie van de positieve elektrode ten opzichte van het hoofd van de embryo's. We verkiezen voor inductie en handhaven verdoving door inhalatie gas via eenvoudige intraperitoneale anesthesie, aangezien de eerste maakt deiets langere narcose vereist een moeilijke operatie. Isofluraan inhalatie resulteert in sneller herstel van anesthesie, aangezien meestal de moeder toont normaal gedrag heeft minuten na de operatie. De eenvoudigste injectiepunt van de DNA-oplossing met de glazen micropipet is de laterale ventrikel, die echter volledig ongeschikt voor hypothalamus elektroporatie. Injectie rechtstreeks in het derde ventrikel is inderdaad cruciaal voor diepe diencephalic structuren te richten. Het is mogelijk om de hypothalamus transfecteren van E12.0 en E12.5 met standaard, off-the-shelf elektroden. We hebben een aantal van de elektroden vervaardigd door Nepa Gene (Chiba, Japan) bijzonder geschikt voor dit doel gevonden.
Met onze procedure transfectie van de gehele hypothalamus neuro-epitheel of gedeeltelijke, regionale transfectie afhankelijk elektrode oriëntatie krijgen we. Hier laten we de techniek door transfecteren van de mammillary lichaam, misschien welde diepste en meest verzonken van alle hypothalame kernen. Daarnaast tonen we gedetailleerde histologische analyse van de getransfecteerde cellen naar het cellulaire niveau van de resolutie.
Een vergelijking van de in utero elektroporatie met andere benaderingen transfecteren van de muis ontwikkelende hersenen in utero te vinden in de sectie discussie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Over de anesthesie: Aangezien in utero elektroporatie in de hypothalamus technisch lastig en vereisen een langere tijd narcose we bij voorkeur inductie en handhaven van verdoving door toediening van een mengsel van zuurstof en isofluraan. In onze ervaring, kunnen dieren goed verdoofd blijven op deze manier voor een periode van maximaal een uur op zijn minst, het herstel van de moeder is erg snel, en de overleving van embryo's verbeterd. Andere benaderingen van anesthesie zijn ook beschikbaar. De meest eenvo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de Duitse Research Foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
Materials
| REAGENTS | |||
| Acepromazine | Sanofi GmbH | anesthetic | |
| Isoflurane | Baxter | HDG9623 | anesthetic |
| Ketamin | Pharma GmbH | anesthetic | |
| Fast Green | Fluka | 44715 | |
| Rimadyl | Pfizer | non-steroidal anti-inflammatory | |
| Braunoderm | Braun | 3887138 | povidone-iodine |
| Phosphate Buffer Saline PBS | Gibco | 14190 | |
| Temgesic (buprenorphine) | Essex Pharma | opioid analgesic | |
| Eye Ointment | Pan-Ophtal | 7136926 | |
| Xylazine | Bayer | ||
| EQUIPMENT | |||
| Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 | Medical Developments Australia | ACN 004 903 682 | |
| Capillary puller P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Compresstome | Precisionary Instr. | VF-300 | Vibratome-type device |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Electroporator | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY21EDIT | |
| Electrode 1 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY550-10 | Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam. |
| Electrode 2 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY700P4L | Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter |
| Fiberoptic cold light source | Leica | KL2500 LCD | |
| Glass capillaries | Harvard Apparatus | GC120T-15 | 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D. |
| Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | FST250 | |
| Heating pad | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
| Injection device | World Precision Instruments | Pneumatic Pico Pump PV820 | |
| Suture Thread Coated Vicryl | Ethicon | V4914 | Peritoneal Suture |
| Suture Thr. Supramid | Serag Wiessner | TO07171L | Skin Suture |
References
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking’ developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).
- Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation. Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice. J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling. Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).
- Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
- Shimogori, T., Grove, E. A. Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation. J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).
- Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern. Front Neurosci. 6, 27 (2012).
- Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
- Vue, T. Y., et al. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
- Tanaka, S., et al. Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).
- Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).
- Canteras, N. S., Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. . The Mouse Nervous System. , 539-562 (2011).
- Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus. Horm. Res. 64, 222-230 (2005).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (31), e1333 (2009).
- Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. A Mouse Model of in Utero Transplantation. J. Vis. Exp. (47), e2303 (2011).
- Altman, J., Bayer, S. A. The Development of the Rat Hypothalamus. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).
- Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105, 7-17 (2001).
- Clancy, B., et al. Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans. Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).
- Ishii, Y., Bouret, S. G. Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice. Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).
- Karim, M. A., Sloper, J. C. Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus. J. Anat. 130, 341-347 (1980).
- Shimada, M., Nakamura, T. Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei. Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).
- Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions. Neural. Dev. 7, 4 (2012).
- Vann, S. D., Aggleton, J. P. The mammillary bodies: two memory systems in one. Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).
- Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O’Shea, K. S. RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos. Genesis. 37, 12-17 (2003).
- Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891 (2012).
- Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection. Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
- Xin, H., et al. The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles. Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus. Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Londrigan, S. L., et al. Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets. Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).
