चूहा केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में Immunohistochemical विश्लेषण और परिधीय लिम्फ नोड ऊतक वर्गों
Summary
We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.
Abstract
Immunohistochemistry (आईएचसी) अत्यधिक, विशिष्ट विश्वसनीय और आकर्षक प्रोटीन दृश्य प्रदान करता है। सही प्रदर्शन और एक आईएचसी आधारित बहुरंगा लेबलिंग की व्याख्या चुनौतीपूर्ण है, खासकर जब इस तरह के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के रूप में एक उच्च वसा सामग्री के साथ ऊतक में लक्ष्य प्रोटीन के बीच interrelations का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है।
हमारी प्रोटोकॉल मानक immunolabeling तकनीक विशेष रूप से चूहे सीएनएस और परिधीय लिम्फ नोड्स (एल.एन.) neuroinflammation से प्रभावित दोनों में संरचनात्मक और घुलनशील प्रोटीन का पता लगाने के लिए समायोजित का शोधन का प्रतिनिधित्व करता है। बहरहाल, के साथ या बिना आगे संशोधनों, हमारे प्रोटोकॉल की संभावना अन्य संबंधित प्रोटीन लक्ष्य का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता अन्य अंगों और प्रजातियों यहाँ प्रस्तुत की तुलना में भी।
Introduction
उन्नत उच्च throughput के उपयोग methylome, transcriptome या यहां तक कि proteome स्तर पर प्रदर्शन विश्लेषण के बावजूद, immunostaining ऊतक का नमूना, सेल संस्कृति में सीधे प्रोटीन का पता लगाने या एक सेल धब्बा के लिए स्वर्ण मानक बनी हुई है। स्थानीयकरण / वितरण पैटर्न का खुलासा करके, immunohistochemistry (आईएचसी) रिश्तेदार अनुपात और लक्ष्य प्रोटीन की स्थलाकृतिक interrelations का आकलन कर सकते हैं, और यहां तक कि उनके जैविक गतिविधियों का संकेत मिलता है। इसलिए, आईएचसी व्यापक रूप से नैदानिक और अनुसंधान प्रयोजनों, जैसे, निदान के लिए, उपचार मूल्यांकन, रोग तंत्र, पशु मॉडल में कार्यात्मक और phenotypical परिवर्तन, आदि के अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है
अनिवार्य रूप से शामिल ऊतक विज्ञान, विकृति विज्ञान, जैव रसायन और इम्यूनोलॉजी, आईएचसी काफी 1941, जब fluorescently लेबल एंटीबॉडी पहली बार संक्रमित ऊतक 1 में न्यूमोकोकल एंटीजन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया के बाद से उन्नत है। वीसेलुलर उत्पादों और आईएचसी द्वारा घटकों के isualization उनकी विशिष्ट प्रतिजन (एजी) के लिए एंटीबॉडी (पेट) के बंधन पर आधारित है। Fluorophore टैग एंटीबॉडी का उपयोग कर इसके अलावा, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं भी peroxidase 2,3 या alkaline फॉस्फेट 4 की तरह एंजाइमों का उपयोग करके देखे जा सकते हैं। इसके अलावा, कोलाइडयन सोने टैग एंटीबॉडी 5, दोनों प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा विशिष्ट प्रतिजन प्रतिरक्षी बातचीत का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है, जबकि रेडियोधर्मी लेबलों autoradiography द्वारा कल्पना कर रहे हैं।
एजी-AB immunoreaction प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष तरीकों के माध्यम से पता लगाया जा सकता है। प्रत्यक्ष विधि अनिवार्य रूप से तेज और सरल है, क्योंकि यह सीधे प्राथमिक पेट 6 लेबल का उपयोग करता है। हालांकि, संवेदनशीलता के महत्वपूर्ण कमी के कारण, अप्रत्यक्ष तरीकों प्रत्यक्ष वालों को पसंद कर रहे हैं। दो कदम अप्रत्यक्ष पता लगाने प्रक्रियाओं प्राथमिक पेट लेबल नहीं किया गया आवश्यकता होती है, पहले के रूप में, और लेबल प्राथमिक पेट के खिलाफ निर्देशित माध्यमिक पेट, दूसरी परत के रूप में 7।संकेत प्रवर्धन आगे को शामिल करके हासिल किया जा सकता है, एंजाइम से मिलकर तृतीयक एबी (तीन कदम अप्रत्यक्ष विधि) माध्यमिक Ab को बांधता है। आमतौर पर इस्तेमाल अप्रत्यक्ष तरीकों का पता लगाने avidin बायोटिन और peroxidase-antiperoxidase (पीएपी) कर रहे हैं। वैकल्पिक रूप से, alkaline फॉस्फेट-antialkaline फॉस्फेट (APAAP) जटिल पीएपी विधि के बजाय प्रयोग किया जा सकता है। विशेष रूप से, alkaline फॉस्फेट (एपी) तरीकों immunoperoxidase तरीकों की तुलना में 4 और भी अधिक संवेदनशील होना दिखाई देते हैं। Avidin बायोटिन परिसर (एबीसी) विधि या तो साथ लेबल avidin बायोटिन परिसर (एलएबी) संयोजन में biotinylated माध्यमिक Ab उपयोग करता है, या streptavidin बायोटिन जटिल (स्लैब) लेबल। संवेदनशीलता का पता लगाने के लिए आगे peroxidase या alkaline फॉस्फेट 8 के साथ लेबल avidin को शामिल करके बढ़ाया जा सकता है। उपयोग में अन्य तरीकों का पता लगाने बहुलक लेबलिंग, tyramine प्रवर्धन और इम्युनो-रोलिंग चक्र 9 रहे हैं। विशेष रूप से, अलग अलग तरीकों का पता लगाने में एक ही ऊतक में कई एजी का पता लगाने के लिए जोड़ा जा सकता हैनमूना है, जो 1978 4। एक साथ डबल यहाँ प्रस्तुत immunostaining में पहली बार बताया गया peroxidase ही सीमित है और एपी संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी, क्रमशः का उपयोग कर formalin तय, आयल एम्बेडेड चूहे सीएनएस और एलएन ऊतक वर्गों में प्रदर्शन किया गया था। संकेतों को क्रमश 3,3'-diaminobencidine (थपका) वर्णकोत्पादक और फास्ट नीले रंग का उपयोग (एफबी) APAAP जटिल, कल्पना थे।
Protocol
Representative Results
Discussion
स्टैंडर्ड आईएचसी प्रक्रियाओं अक्सर एक इष्टतम परिणाम है, जो आमतौर पर व्यापक अनुभव है लेकिन यह भी "परीक्षण और त्रुटि" दृष्टिकोण का तात्पर्य प्राप्त करने के लिए विशिष्ट समायोजन की आवश्यकता है। ऊतक त?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hans Lassmann and Jan Bauer for their guidance and support. We also thank Katalin Benedek for excellent technical assistance and Caroline Westerlund for critical and linguistic appraisal.
This study was supported by grants from Biogen Idec, the Wenner-Gren Foundation, the Swedish Research Council, the Swedish Association of Persons with Neurological Disabilities, Swedish Brain Foundation, the EU 6TH Framework EURATools (LSHG-CT-2005-019015) and Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) | Baxter | 1001936060 | Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment. |
| Sodiumchloride (NaCl) | Merck | 1.0604 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 – 100), 4% in 1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity. |
| Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | Flamable. |
| Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 | Flamable. Acute toxicity. |
| Histo-Comp Paraffin Wax | Tissue-Tek | V0-5-1001 | |
| Adhesive Microscope Slides | Starfrost | MIC-1040-W | |
| Xylol substitute XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | Respiratory sensitization. Carcinogenicity. |
| α- CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA48G | |
| α- Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody | Millipore | MABN92 | |
| α- CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA341R | |
| α- eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody | Dakopatts, Denmark | D0314 | |
| Biotinylated secondary antibody | Amersham Biotech | RPN1025 | |
| Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) | Sigma-Aldrich | A3151 | |
| Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) | Sigma-Aldrich | N4875-1G | Acute toxicity. |
| Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | Acute toxicity. |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) | DAKO | S3000 | Highly flammable. Toxic. |
| Copper sulphate (CuSO4) | Merck | 1.02791 | Acute toxicity. Environmental hazzard. |
| GelTol Aqueous Mounting Medium | Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) | Merck | 107210 | Acute toxicity. |
| Methanol (CH3OH) | Fluka | 65543 | Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable. |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) | AppliChem | A1379 | Skin and eye irritation. |
| Tris Buffered Saline (TBS), tablet | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) | Merck | 1.0658 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) | Merck | 1.06346 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| DAKO cytomation wash buffer 10x | DAKO | S3006 | Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming. |
| N,N- Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | Flammable. Acute toxicity. |
| Glas coverslips 24 x 36 mm | Menzel-Gläser | BB024036A1 | |
| Hydrochloric acid, conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Hydrochloric acid solution volumetric, 2M HCl (2N) | Fluka | 71826 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) | Sigma-Aldrich | S2252 | Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment. |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | Oral exposures may cause reproductive and developmental effects. |
| Equipment | |||
| Tissue-Tek V.I.P Vacuum Infiltration Processor | Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz | |
| Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome | Hacker instruments | ||
| Household food steamer | Braun | MultiGourmet FS 20 | |
| Light microscope | Leica Polyvar 2 |
References
- Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
- Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).
- Mason, D. Y., Sammons, R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).
- Polak, J. M., Van Noorden, S. . Introduction to immunocytochemistry. , (2003).
- Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods. American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).
- Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Vet Pathol. 42, 405-426 (2005).
- Adzemovic, M. Z., et al. Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats. PloS one. 7, 39794 (2012).
- Bauer, J., et al. Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes. Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).
- Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord. The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).
- Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).
- Hirasawa, T., et al. Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).
- Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature. 336, 79-81 (1988).
- Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).
- Hayat, M. . Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy. , (2002).
- Boenisch, T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).
- Huang, S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).
- Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).
- Taylor, C. R., Shi, S. R. Antigen retrieval: call for a return to first principles. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).
- Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).
- Nelson, P. N., et al. Monoclonal antibodies. Molecular pathology : MP. 53, 111-117 (2000).
- Van der Loos, C. . Immunoenzyme multiple staining methods. , (1999).
- Elias, J. . Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis. , (2003).
- Straus, W. Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).
- Streefkerk, J. G. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).
- Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).
- Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones. Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).
- Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells. The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
