جيل من العضلية الإنسان: البروتوكول التمايز من خالية من الطاعم المستحثة الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان

Summary

الخلايا الجذعية المحفزة، إما خلايا الجنينية الجذعية المحفزة أو المستحثة (آي بي إس)، تشكل مصدرا قيما للخلايا متمايزة الإنسان، بما في ذلك العضلية. هنا، سوف نركز على الاستقراء القلب من خلايا الجذع، والتي تبين كيفية استخدامها للحصول العضلية الإنسان وظيفية من خلال بروتوكول مضغي الشكل القائم على الجثث.

Abstract

من أجل التحقيق في الأحداث التي وقعت القيادة القلب والتنمية لتحديد الآليات الجزيئية التي تؤدي إلى أمراض عضلة القلب في البشر، فمن الضروري أولا لتوليد العضلية الإنسان وظيفية (CMS). ومن شأن استخدام هذه الخلايا في اكتشاف المخدرات ودراسات علم السموم تكون أيضا مفيدة للغاية، مما يسمح للجزيئات الدوائية جديدة لعلاج اضطرابات القلب يمكن التحقق من صحة ما قبل سريريا على خلايا المنشأ البشرية. من المصادر المحتملة للCMS، الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (آي بي إس) هي من بين الأكثر واعدة، لأنها يمكن أن تستمد مباشرة من الأنسجة للمريض في متناول الجميع وتكون لديها قدرة ذاتية تثير جميع أنواع الخلايا في الجسم ^1. وقد اقترحت عدة طرق للتمييز بين خلايا الجذع في CMS، بدءا من الهيئات مضغي الشكل الكلاسيكي (EBS) نهج التجميع إلى بروتوكولات محددة الصفات كيميائيا ^2،3. في هذه المقالة نقترح بروتوكول المستندة EBS، وتظهر كيف أن هذا methoويمكن استخدام D لتوليد بكفاءة وظيفية CM-مثل خلايا من خلايا الجذع خالية من وحدة التغذية.

Introduction

تاريخيا، وقد استند التحقيق في الآليات الجينية والجزيئية القيادة التنمية البشرية ومرض على توليد النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا. ومع ذلك، تفشل العديد من الظواهر البشرية لتكراره بنجاح في الفئران، وذلك أساسا بسبب الاختلافات البيولوجية القائمة بين هذين النوعين. من ناحية أخرى، والوصول إلى الأنسجة البشرية قد تكون محدودة وغالبا لا تسمح ما يكفي من المواد التي يمكن الحصول عليها لإجراء دراسات تجريبية متعمقة. مجال البيولوجيا القلب والأوعية الدموية يعاني من كل هذه القيود: علم وظائف الأعضاء من قلب الإنسان يختلف كثيرا عن أن من الفأرة، وكمية كبيرة من أنسجة القلب يمكن الوصول إليها إلا بعد الوفاة أو أثناء عملية جراحية في القلب. العثور على مصدر الأمثل للتمايز وظيفي الإنسان مضادة وبالتالي تصبح موضوعا مركزيا في علم الأحياء القلب والأوعية الدموية، وأحرز الكثير من الجهد لمعالجة هذه المسألة. وقد اقترحت أنواع الخلايا المختلفة، وأناالتسبب myoblasts الهيكل العظمي والخلايا الجذعية المحلية القلب، العظام والخلايا وحيدات النوى نخاع، أسلاف البطانية، والخلايا الجذعية الوسيطة. ومع ذلك، الحصول على بيانات باستخدام هذه الخلايا لم تكن متسقة ^4.

اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ESC) أولا ⁽⁵⁾ واكتشاف حجر الأساس لمشروع يسببها الجذعية (آي بي إس) الخلايا المحفزة بواسطة ياماناكا وطومسون ^6،7 بدا في وقت لاحق لتقديم الحلول: هذه الخلايا لها القدرة على النمو إلى أجل غير مسمى والقدرة على إعطاء ترتفع إلى جميع مشتقات الخلية من الطبقات الجرثومية الثلاث، بما في ذلك اتفاقية الأنواع المهاجرة. استخدام خلايا الجذع يقدم المزيد من المزايا: مشتق من خلايا بالغة ذاتي، وأنها تحمل نفس الجينوم كما الفرد أو المريض من التي تشتق منها. وبالتالي يسمح بتطوير نماذج في المختبر أن تسهيل التحقيق في الأمراض وآليات التنمية الجينية البشرية. في فضيلة من هذه الخاصية، يمكن خلايا الجذع أيضا سمشاكل vercome المتعلقة الرفض المناعي والقضايا الأخلاقية ^8. لهذه الأسباب، على الرغم من المجالس الاقتصادية والاجتماعية لا تزال تمثل المعيار الذهبي في مجال بيولوجيا الخلايا الجذعية، والباحثين في جميع أنحاء العالم تتجه الآن نحو مزيد من تكنولوجيا خلايا الجذع.

ويجري الآن توظيف خلايا الجذع لنموذج المرض البشري في المختبر لمختلف الظروف، بما في ذلك اضطرابات القلب والأوعية الدموية الخلقية ^9،10. في الآونة الأخيرة، وقد تم تنفيذ تطبيق الجذع خلية النمذجة المرض لالأحادية الجين اضطرابات القلب (أي متلازمات QT طويلة، كاتيكولاميني متعددة الأشكال تسرع القلب البطيني) وأمراض في القلب العيوب التي هي جزء من النمط الظاهري المعقدة (مثل ليوبارد ومتلازمات تيموثي، تمدد عضلة القلب). وأكدت هذه التقارير أن الخلايا المحفزة المريض محددة أن يتم التمييز في مضادة عرض الخصائص المظهرية والوظيفية مشابهة لهذا المرض في الجسم الحي.

ومع ذلك، هناكلا تزال العديد من التحديات لتحسين فعالية تحريض خلايا الجذع في النسب القلب. جيل عفوية اتفاقية الأنواع المهاجرة من المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان عبر تشكيل التجميعية دعا الهيئات مضغي الشكل (EBS) أثبتت نجاح ^17. منذ هذا الاكتشاف، تم اقتراح العديد من الطرق الأخرى. وقد عززت العديد من الجماعات كثيرا من كفاءة بروتوكول التمايز وانتقلوا نحو الكواشف ثقافة محددة كيميائيا وخالية من المنتجات الحيوانية (انظر التمثيل الصامت، C.، وآخرون، بحوث تداول (2012) لإجراء استعراض شامل لجميع الأساليب القائمة ³ ).

ومع ذلك، فإن الأسلوب الكلاسيكي على أساس تجميع EB لا يزال يمثل الأكثر استخداما لإجراء الدراسات الفنية والتحقيق في آليات المرض. ويستند لدينا البروتوكول المقترح على تجميع خلايا الجذع في EBS والثقافة في وجود حمض الاسكوربيك والمصل، وهو ما ثبت لتعزيز عملية تمايز القلب وصتؤثر sitively نضوج هذه الخلايا ^18،19. في هذه المقالة سوف تذهب من خلال هذه المنهجية بالتفصيل وسوف تظهر كيفية استخدام خالية من تغذية خطوط الخلايا المحفزة لتوليد المريض محددة IPS-مشتقة اتفاقية الأنواع المهاجرة.

Protocol

1. صيانة خالية من الطاعم والركض من الجذع خطوط الخلايا البشرية إعداد الأطباق على Matrigel المغلفة. ذوبان الجليد قارورة واحدة من الإنسان ماتريكس ESC-المؤهلين على الجليد لمدة ساعة واحدة وتمييع في 25 مل DMEM-F12 المتوسطة. إضافة 1 مل ?…

Representative Results

في دراساتنا ولدت لنا مضادة من عدة خطوط الخلايا المحفزة. وقد تم توليد هذه السطور مبدئيا على طبقة المغذية MEF لكنها وضعت على الفور على Matrigel باستخدام وسيلة تعريف (إما mTESR1 أو Nutristem). واستخدمت مختلف المقايسات للتحقق من الحفاظ على الخصائص المورفولوجية، والتعبير عن علامات نمو…

Discussion

الخلايا الجذعية المحفزة لديها القدرة على التفريق بصورة عفوية إلى CMS، ولو مع انخفاض كفاءة والتباين الشديد بين السطور. ولذلك فقد ركزت تطوير طرق تحريض رواية على تحسين كفاءة العملية والتحرك نحو بروتوكولات أكثر تحديدا. ومع ذلك، فإن معظم هذه الأساليب التمايز جديدة معقدة ج…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
			Media and Reagents
Human ESC-qualified Matrix	BD Biosciences	354277	Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C .
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution	Sigma	F0896-2MG	Working concentration: 5 μg/cm2
Laminin	Sigma	L2020-1MG	Working concentration: 5 μg/cm2
PBS (no Mg and Ca), 10X	Lonza	BE17-515F
PBS (with Mg and Ca), 10X	Bio Sera	XC-S2067/500
Dispase II, neutral protease, grade II	Roche	4942078001	Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)
Trypsin/EDTA, 0.5%	Sigma	T3924
Collagenase type 2	Worthington	4176	Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca
DMEM-F12	Life Technologies	21331-020
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828-028	Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C
Foetal Bovine Serum (origin South America)	Invitrogen	10270-106	Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X	Life Technologies	15140-122
GlutaMAX, 100X	Life Technologies	35050-038
MEM NEAA, 100X	Invitrogen	11140-135
N2 supplement, 100X	Life Technologies	17502-048
B27 supplement, 50X	Life Technologies	12587-010
2-mercaptoethanol	Invitrogen	31350-010
Gelatin, from porcine skin	Sigma	G1890-100G	Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850	Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week
Nutristem hESC XF	Stemgent from Biological Industries	05-100-1A	Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week.
mFreSR	Stem Cell Technologies	5853
Ascorbic acid	Sigma	A4544-25G	Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)
			Plasticware
35 mm culture dishes	Becton Dickinson	353001
Cell scraper	Corning Incorporated	3008
12-well plates	Becton Dickinson	353043
Permanox 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177437
Glass 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177380
6-well plates, ultra-low-attachment surface	Corning Incorporated	3471
18G needle	Becton Dickinson	304622
Glass pasteur pipettes, 230 mm	VWR International	612-1702
2.5 ml syringe	Becton Dickinson	300188
			Equipments
IVF Workstation	KSystem, by Nikon
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope	Nikon