Generering av Human Cardiomyocytes: differentiering protokoll från Feeder-fria mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

Summary

Pluripotenta stamceller, antingen embryonala eller inducerad pluripotenta stamceller (iPS-celler), utgör en värdefull källa för humana differentierade celler, inklusive hjärtmuskelceller. Här kommer vi att fokusera på hjärt induktion av iPS-celler, som visar hur man använder dem för att uppnå funktionella mänskliga hjärtmuskelceller genom en embryoid organ-baserat protokoll.

Abstract

För att utreda händelserna kör hjärta utveckling och att bestämma de molekylära mekanismer som leder till hjärtinfarkt sjukdomar hos människor, är det viktigt först att generera funktionella mänskliga hjärtmuskelceller (CMS). Användningen av dessa celler i läkemedelsutveckling och toxicologystudier skulle också vara till stor nytta, vilket gör att nya farmakologiska molekyler för behandling av hjärtsjukdomar som ska valideras prekliniskt på celler av mänskligt ursprung. Av de möjliga källor till CMS inducerade pluripotenta stamceller (iPS-celler) är bland de mest lovande, eftersom de kan härledas direkt från lättillgänglig patientvävnad och har en inneboende förmåga att ge upphov till alla celltyper i kroppen ^1. Flera metoder har föreslagits för att differentiera iPS-celler på cms, allt från de klassiska embryoidkroppar (EBS) aggregering förhållningssätt till kemiskt definierade protokoll ^2,3. I denna artikel kommer vi föreslå en EBS-baserat protokoll och visa hur denna method kan användas för att effektivt generera funktionella CM-liknande celler från feeder-fria iPS-celler.

Introduction

Historiskt sett har undersökningen av de genetiska och molekylära mekanismer som driver mänsklig utveckling och sjukdom varit baserad på generering av genmodifierade djurmodeller. Men många mänskliga fenotyper undgå att framgångsrikt replikeras i möss, främst på grund av de biologiska skillnaderna mellan de två arterna. Å andra sidan, har tillgång till mänskliga vävnader kan vara begränsad och ofta inte tillräckligt med material för att erhållas för fördjupade experimentella studier. Området kardiovaskulär biologi lider båda dessa begränsningar: fysiologi människans hjärta är väsentligt annorlunda än musen, och en betydande mängd av hjärtat vävnad är tillgänglig endast efter slakt eller vid hjärtoperationer. Att hitta en optimal källa för differentiering av funktionella human CMS har därför blivit en central fråga i kardiovaskulär biologi, och stora ansträngningar har gjorts för att ta itu med denna fråga. Olika celltyper har föreslagits, including skelettet myoblasts, lokala hjärt stamceller, benmärg mononukleära celler, endotelceller stamceller och mesenkymala stamceller. Men, erhålles data med dessa celler har inte varit konsekvent ^4.

För utvinning av mänskliga embryonala stamceller (ESC) första ⁵ och den banbrytande upptäckten av inducerade (iPS) pluripotenta stamceller från Yamanaka och Thomson ^6,7 verkade senare att erbjuda lösningar: dessa celler har förmågan att växa på obestämd tid och möjlighet att ge upphov till alla celler derivat av de tre groddblad, inklusive CMS. Användningen av iPS-celler ger ytterligare fördelar: som härrör från autologa adulta celler, bär de samma arvsmassa som individ eller patient från vilken de härrör. De tillåter därför utvecklingen av in vitro-modeller som underlättar utredningen av genetiska sjukdomar och mekanismer för utveckling. I kraft av denna egenskap, kan iPS-celler o ocksåvercome problem relaterade till avstötning och etiska frågor ^8. Av dessa skäl, även om ekonomiska och sociala råd utgör fortfarande den gyllene standarden inom stamcellsbiologi, är forskare i hela världen går nu mer mot iPS cell-teknik.

iPS-celler är nu anställd för att modellera människans sjukdom in vitro för olika förhållanden, bland annat medfödda kardiovaskulära sjukdomar ^9,10. Nyligen, har tillämpningen av iPS-cell sjukdom modellering utförts för monogena hjärtsjukdomar (dvs lång QT-syndrom, katekolaminerga polymorf ventrikeltakykardi) och sjukdomar som hjärtfel är en del av ett komplex fenotyp (dvs. Leopard och Timothy syndrom, dilaterad kardiomyopati). Dessa rapporter bekräftade att patientspecifika iPS-celler som är differentierade på cms uppvisar liknande fenotypiska och funktionella egenskaper som sjukdomen in vivo.

Det finns dockfinns fortfarande många utmaningar för att förbättra effektiviteten av inducera iPS-cellerna in i hjärt-härstamning. Spontan generering av CM från mänskliga ESCs via aggregatbildning kallas embryoidkroppar (EBS) har visat sig framgångsrika ^17. Efter denna upptäckt har många andra metoder föreslagits. Många grupper har ökat effektiviteten av differentiering protokoll och har gått mot kemiskt definierade och animaliska biprodukt-fri kultur reagens (se Mummery, C, et al., Circulation Research (2012) för en omfattande översyn av alla befintliga metoder ³ ).

Ändå representerar den klassiska metoden bygger på EB aggregering fortfarande den mest använda för att utföra funktionella studier och undersöka sjukdomsmekanismer. Vår föreslagna protokollet bygger på aggregering av iPS-celler till EB och kultur i närvaro av serum och askorbinsyra, vilket har visat sig öka hjärt differentiering processen och positively påverka mognaden av dessa celler ^18,19. I denna artikel kommer vi att gå igenom denna metod i detalj och kommer att visa hur man använder feeder-fria iPS cellinjer för att generera patientspecifika iPS-härledda CMS.

Protocol

Ett. Feeder-free Underhåll och Passaging av mänskliga iPS cellinjer Förbered Matrigel-belagda rätter. Thaw en injektionsflaska av humant ESC-kvalificerad Matrix på is under en timme och späd den i 25 ml DMEM-F12-medium. Tillsätt 1 ml till vardera 35 mm platta (eller motsvarande belopp per yta om andra rätter används), hålla allt på is och se till att alla plåtar och rör är förkyld. Täck plattorna med aluminiumfolie. Obs: Matrigel stock koncen…

Representative Results

I våra studier har vi genererat CM från flera iPS cellinjer. Dessa rader ursprungligen genererades på en MEF matare lager men placerades omedelbart på Matrigel använda ett definierat medium (antingen mTESR1 eller Nutristem). Olika analyser användes för att kontrollera underhåll av morfologiska egenskaper, uttrycket av markörer typiska av pluripotenta celler (OCT-4, SSEA4 och TRA1-60) och deras genom stabilitet (figur 1). Induktion in i hjärt härstamning utlöstes …

Discussion

Pluripotenta stamceller har potential att differentiera spontant på cms, om än med låg verkningsgrad och hög variabilitet mellan raderna. Utvecklingen av nya induktion metoder har därför fokuserat på att effektivisera processen och går mot mer definierade protokoll. Men de flesta av dessa nya differentiering metoder är ganska komplicerat och kräver genomarbetade odlingsbetingelser, fin styrning av timing och koncentration av reagens, och behandling med dyra cytokiner och tillväxtfaktorer. Även skillnader i d…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
			Media and Reagents
Human ESC-qualified Matrix	BD Biosciences	354277	Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C .
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution	Sigma	F0896-2MG	Working concentration: 5 μg/cm2
Laminin	Sigma	L2020-1MG	Working concentration: 5 μg/cm2
PBS (no Mg and Ca), 10X	Lonza	BE17-515F
PBS (with Mg and Ca), 10X	Bio Sera	XC-S2067/500
Dispase II, neutral protease, grade II	Roche	4942078001	Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)
Trypsin/EDTA, 0.5%	Sigma	T3924
Collagenase type 2	Worthington	4176	Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca
DMEM-F12	Life Technologies	21331-020
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828-028	Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C
Foetal Bovine Serum (origin South America)	Invitrogen	10270-106	Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X	Life Technologies	15140-122
GlutaMAX, 100X	Life Technologies	35050-038
MEM NEAA, 100X	Invitrogen	11140-135
N2 supplement, 100X	Life Technologies	17502-048
B27 supplement, 50X	Life Technologies	12587-010
2-mercaptoethanol	Invitrogen	31350-010
Gelatin, from porcine skin	Sigma	G1890-100G	Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850	Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week
Nutristem hESC XF	Stemgent from Biological Industries	05-100-1A	Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week.
mFreSR	Stem Cell Technologies	5853
Ascorbic acid	Sigma	A4544-25G	Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)
			Plasticware
35 mm culture dishes	Becton Dickinson	353001
Cell scraper	Corning Incorporated	3008
12-well plates	Becton Dickinson	353043
Permanox 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177437
Glass 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177380
6-well plates, ultra-low-attachment surface	Corning Incorporated	3471
18G needle	Becton Dickinson	304622
Glass pasteur pipettes, 230 mm	VWR International	612-1702
2.5 ml syringe	Becton Dickinson	300188
			Equipments
IVF Workstation	KSystem, by Nikon
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope	Nikon