Summary

Ultraperformance लिक्विड क्रोमैटोग्राफी उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री (UPLC-HRMS) का उपयोग जैविक स्रोतों से अलक्षित Metabolomics

Published: May 20, 2013
doi:

Summary

अलक्षित metabolomics एक चयापचय प्रोफ़ाइल के स्नैपशॉट सृजन एक परिकल्पना प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल सीरम कोशिकाओं, या ऊतक से मेटाबोलाइट्स की निकासी और विश्लेषण प्रदर्शन करेंगे. मेटाबोलाइट्स की एक श्रेणी तरल तरल चरण निष्कर्षण का उपयोग कर सर्वेक्षण कर रहे हैं, microflow ultraperformance तरल क्रोमैटोग्राफी / अंतर विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए युग्मित उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री (UPLC-HRMS).

Abstract

यहाँ हम सहित हित के जैविक नमूने लिए चयापचय प्रोफाइल का विश्लेषण करने के लिए एक कार्यप्रवाह वर्तमान; कोशिकाओं, सीरम, या ऊतक. नमूना पहले एक तरल तरल चरण निष्कर्षण द्वारा ध्रुवीय और गैर ध्रुवीय भागों में अलग, और आंशिक रूप से बहाव के विश्लेषण की सुविधा के लिए शुद्ध होता है. प्रारंभिक निष्कर्षण के जलीय (ध्रुवीय मेटाबोलाइट्स) और जैविक दोनों (गैर ध्रुवीय मेटाबोलाइट्स) चरणों मेटाबोलाइट्स के एक विस्तृत रेंज सर्वेक्षण करने के लिए कार्रवाई कर रहे हैं. मेटाबोलाइट्स उनके विभाजन के गुणों पर आधारित विभिन्न तरल क्रोमैटोग्राफी तरीकों से अलग हो रहे हैं. इस विधि में, हम (उत्तर प्रदेश) नियंत्रण रेखा के तरीकों microflow अति प्रदर्शन मौजूद है, लेकिन प्रोटोकॉल उच्च प्रवाह और कम दबाव के लिए स्केलेबल है. मास स्पेक्ट्रोमीटर में परिचय सामान्य या यौगिक अनुकूलित स्रोत की स्थिति में या तो के माध्यम से किया जा सकता है. आयनों की एक व्यापक रेंज का पता लगाने के लिए एक हाल ही में ग पर उच्च संकल्प का उपयोग करते हुए एक व्यापक मी / z सीमा पर सकारात्मक और नकारात्मक दोनों मोड में पूर्ण स्कैन मोड में किया जाता हैसाधन alibrated. लेबल मुक्त अंतर विश्लेषण जैव सूचना विज्ञान प्लेटफार्मों पर किया जाता है. इस दृष्टिकोण के आवेदन चयापचय मार्ग स्क्रीनिंग, biomarker खोज, और नशीली दवाओं के विकास में शामिल हैं.

Introduction

HRMS के क्षेत्र में हाल ही में तकनीकी प्रगति के कारण, अलक्षित, परिकल्पना पैदा metabolomics दृष्टिकोण जटिल नमूनों का विश्लेषण करने के लिए एक व्यावहारिक दृष्टिकोण बन गए हैं. लाख प्रति दिनचर्या कम हिस्से की सुविधा 100,000 संकल्प (पीपीएम) जन सटीकता के लिए सक्षम 1 मास स्पेक्ट्रोमीटर व्यापक रूप से हो गए हैं कई विक्रेताओं से उपलब्ध है. 2,3 इस जन सटीकता अधिक से अधिक विशिष्टता और विश्लेष्य पहचान, समस्थानिक पैटर्न मान्यता, और अभिवर्तन पहचान की एक प्रारंभिक काम में विश्वास की अनुमति देता है. 4 एक उचित निकासी प्रक्रिया और उच्च प्रदर्शन नियंत्रण रेखा या UPLC, जटिल मिश्रण के साथ युग्मित अवधारण समय डेटा से प्राप्त अतिरिक्त विशिष्टता के साथ विश्लेषण किया जा सकता है. 5 UPLC अधिक chromatographic दक्षता के पास है और जिसके परिणामस्वरूप बड़े डेटासेट किसी में एकीकृत किया जा सकता है संभव metabolome. 6 का एक बड़ा कवरेज बनाने के लिए अधिक से अधिक संवेदनशीलता, संकल्प और विश्लेषण समय की अनुमति देता हैकई अंतर विश्लेषण सॉफ्टवेयर और उपयोगी पैटर्न या ब्याज के व्यक्तिगत analytes के लिए खनन. 7,8,9,10,11 ख्यात हिट शुरू में चोटी का पता लगाने एल्गोरिदम का एक संयोजन, सटीक जन आधारित रासायनिक सूत्र भविष्यवाणी, विखंडन भविष्यवाणी का उपयोग कर पहचाना जा सकता है, और के रासायनिक डेटाबेस खोज. इस दृष्टिकोण की अनुमति देता है समय लेने वाली पूर्ण संरचनात्मक पहचान के लिए या अधिक संवेदनशील और अधिक विशिष्ट स्थिर आइसोटोप कमजोर पड़ने के विकास के लिए लक्ष्य UPLC / चयनित या एकाधिक प्रतिक्रिया की निगरानी / मात्रा का ठहराव के लिए वर्तमान सोने के मानक तरीके हैं कि एमएस पढ़ाई. 12 की प्राथमिकता

जैविक नमूने की बदलती प्रकृति मूत्र 13, 14 कोशिकाओं, सीरम 15, या ऊतक 16 के लिए निकासी प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए प्रेरित किया है. इस प्रोटोकॉल सुविधाओं एक्सट्रेक्शन कोशिकाओं, सीरम, और ऊतकों के लिए. जहां उपयुक्त हो, टिप्पणियों और अतिरिक्त संदर्भ संशोधन के लिए शामिल किया गया हैप्रक्रिया के माहौल स्थिर आइसोटोप के शामिल किए जाने का पता, या विशेष रूप से अस्थिर मेटाबोलाइट्स के शामिल किए जाने के लिए करने के लिए.

Protocol

1. कोशिकाओं से नमूने निकालना कोशिकाओं की एक 10 सेमी की थाली के लिए: एक पूर्व लेबल 10 मिलीलीटर गिलास अपकेंद्रित्र ट्यूब में मीडिया में उठाया सेल निलंबन के 1.5 मिलीलीटर इकट्ठा. पक्षपाती लाइनों के लिए, कोशि?…

Representative Results

परिणाम प्रस्तुत कीटनाशक और mitochondrial परिसर मैं अवरोध rotenone साथ एसएच SY5Y glioblastoma कोशिकाओं का एक 6 घंटा उपचार से चयनित डेटा बताते हैं. संक्षिप्तता के लिए, केवल जैविक चरण सकारात्मक मोड डेटा प्रस्तुत किया है. नमूने संस…

Discussion

अलक्षित metabolomics अंतर्जात या जीनोबायोटिक biotransformations की जांच, या ब्याज का एक नमूना से एक चयापचय प्रोफाइल पर कब्जा करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है. संकल्प और संवेदनशीलता उत्पन्न बड़े डेटासेट के स?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम एनआईएच अनुदान P30ES013508 और 5T32GM008076 के समर्थन को स्वीकार करते हैं. हम भी चलनी 2.0 और डीआरएस के उपयोग के लिए थर्मो वैज्ञानिक धन्यवाद. उपयोगी विचार विमर्श के लिए यूजीन Ciccimaro और थर्मो वैज्ञानिक के मार्क सैंडर्स.

Materials

      Reagent
Phosphate Buffered Saline Mediatech 21-031-CM  
Water (H2O) Fisher Scientific W7-4 (optima)
Acetonitrile (CH3CN) Fisher Scientific A996-4 (optima)
Methanol (CH3OH) Fisher Scientific A454-4 (optima)
Isopropanol Fisher Scientific A464-4 (optima)
Chloroform (CH3Cl) Sigma-Aldrich 366927 Hazard
Dichloromethane (CH2Cl2) Acros Organics 61030-1000 To replace chloroform
Diethyl Ether Sigma-Aldrich 346136 To replace chloroform
Formic Acid (FA) Fisher Scientific   (optima)
NH4OH Fisher Scientific A470-250 (optima)
Ammonium formate (HCOONH4) Sigma-Aldrich 78314  
MicroSpin C18 Columns Nest Group Inc SS18V  
Pasteur Pipettes Fisher Scientific 13-678-200  
10 ml Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 73785-10  
10 ml Plastic Centrifuge Tubes CellTreat CLS-4301-015  
LC Vials (glass) Waters 60000751CV  
LC Inserts (glass) Waters WAT094171  
LC Vials (plastic) Waters 186002640  
0.22 μm Filters Corning 8169 nylon
2 ml Eppendorf Tubes BioExpress C-3229-1 Low Retention
      Equipment
High Resolution Mass Spectrometer Thermo Scientific LTQ XL-Orbitrap  
HPLC/UPLC Waters nanoACQUITY UPLC  
Source Michrom Thermo Advance Source  
Differential Analysis Software Thermo Scientific SIEVE 2.0  
nanoACQUITY C18 BEH130 Waters 186003546 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm
Acentis Express C8 Sigma-Aldrich 54262 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm

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Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), e50433, doi:10.3791/50433 (2013).

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