अलक्षित metabolomics एक चयापचय प्रोफ़ाइल के स्नैपशॉट सृजन एक परिकल्पना प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल सीरम कोशिकाओं, या ऊतक से मेटाबोलाइट्स की निकासी और विश्लेषण प्रदर्शन करेंगे. मेटाबोलाइट्स की एक श्रेणी तरल तरल चरण निष्कर्षण का उपयोग कर सर्वेक्षण कर रहे हैं, microflow ultraperformance तरल क्रोमैटोग्राफी / अंतर विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए युग्मित उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री (UPLC-HRMS).
यहाँ हम सहित हित के जैविक नमूने लिए चयापचय प्रोफाइल का विश्लेषण करने के लिए एक कार्यप्रवाह वर्तमान; कोशिकाओं, सीरम, या ऊतक. नमूना पहले एक तरल तरल चरण निष्कर्षण द्वारा ध्रुवीय और गैर ध्रुवीय भागों में अलग, और आंशिक रूप से बहाव के विश्लेषण की सुविधा के लिए शुद्ध होता है. प्रारंभिक निष्कर्षण के जलीय (ध्रुवीय मेटाबोलाइट्स) और जैविक दोनों (गैर ध्रुवीय मेटाबोलाइट्स) चरणों मेटाबोलाइट्स के एक विस्तृत रेंज सर्वेक्षण करने के लिए कार्रवाई कर रहे हैं. मेटाबोलाइट्स उनके विभाजन के गुणों पर आधारित विभिन्न तरल क्रोमैटोग्राफी तरीकों से अलग हो रहे हैं. इस विधि में, हम (उत्तर प्रदेश) नियंत्रण रेखा के तरीकों microflow अति प्रदर्शन मौजूद है, लेकिन प्रोटोकॉल उच्च प्रवाह और कम दबाव के लिए स्केलेबल है. मास स्पेक्ट्रोमीटर में परिचय सामान्य या यौगिक अनुकूलित स्रोत की स्थिति में या तो के माध्यम से किया जा सकता है. आयनों की एक व्यापक रेंज का पता लगाने के लिए एक हाल ही में ग पर उच्च संकल्प का उपयोग करते हुए एक व्यापक मी / z सीमा पर सकारात्मक और नकारात्मक दोनों मोड में पूर्ण स्कैन मोड में किया जाता हैसाधन alibrated. लेबल मुक्त अंतर विश्लेषण जैव सूचना विज्ञान प्लेटफार्मों पर किया जाता है. इस दृष्टिकोण के आवेदन चयापचय मार्ग स्क्रीनिंग, biomarker खोज, और नशीली दवाओं के विकास में शामिल हैं.
HRMS के क्षेत्र में हाल ही में तकनीकी प्रगति के कारण, अलक्षित, परिकल्पना पैदा metabolomics दृष्टिकोण जटिल नमूनों का विश्लेषण करने के लिए एक व्यावहारिक दृष्टिकोण बन गए हैं. लाख प्रति दिनचर्या कम हिस्से की सुविधा 100,000 संकल्प (पीपीएम) जन सटीकता के लिए सक्षम 1 मास स्पेक्ट्रोमीटर व्यापक रूप से हो गए हैं कई विक्रेताओं से उपलब्ध है. 2,3 इस जन सटीकता अधिक से अधिक विशिष्टता और विश्लेष्य पहचान, समस्थानिक पैटर्न मान्यता, और अभिवर्तन पहचान की एक प्रारंभिक काम में विश्वास की अनुमति देता है. 4 एक उचित निकासी प्रक्रिया और उच्च प्रदर्शन नियंत्रण रेखा या UPLC, जटिल मिश्रण के साथ युग्मित अवधारण समय डेटा से प्राप्त अतिरिक्त विशिष्टता के साथ विश्लेषण किया जा सकता है. 5 UPLC अधिक chromatographic दक्षता के पास है और जिसके परिणामस्वरूप बड़े डेटासेट किसी में एकीकृत किया जा सकता है संभव metabolome. 6 का एक बड़ा कवरेज बनाने के लिए अधिक से अधिक संवेदनशीलता, संकल्प और विश्लेषण समय की अनुमति देता हैकई अंतर विश्लेषण सॉफ्टवेयर और उपयोगी पैटर्न या ब्याज के व्यक्तिगत analytes के लिए खनन. 7,8,9,10,11 ख्यात हिट शुरू में चोटी का पता लगाने एल्गोरिदम का एक संयोजन, सटीक जन आधारित रासायनिक सूत्र भविष्यवाणी, विखंडन भविष्यवाणी का उपयोग कर पहचाना जा सकता है, और के रासायनिक डेटाबेस खोज. इस दृष्टिकोण की अनुमति देता है समय लेने वाली पूर्ण संरचनात्मक पहचान के लिए या अधिक संवेदनशील और अधिक विशिष्ट स्थिर आइसोटोप कमजोर पड़ने के विकास के लिए लक्ष्य UPLC / चयनित या एकाधिक प्रतिक्रिया की निगरानी / मात्रा का ठहराव के लिए वर्तमान सोने के मानक तरीके हैं कि एमएस पढ़ाई. 12 की प्राथमिकता
जैविक नमूने की बदलती प्रकृति मूत्र 13, 14 कोशिकाओं, सीरम 15, या ऊतक 16 के लिए निकासी प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए प्रेरित किया है. इस प्रोटोकॉल सुविधाओं एक्सट्रेक्शन कोशिकाओं, सीरम, और ऊतकों के लिए. जहां उपयुक्त हो, टिप्पणियों और अतिरिक्त संदर्भ संशोधन के लिए शामिल किया गया हैप्रक्रिया के माहौल स्थिर आइसोटोप के शामिल किए जाने का पता, या विशेष रूप से अस्थिर मेटाबोलाइट्स के शामिल किए जाने के लिए करने के लिए.
अलक्षित metabolomics अंतर्जात या जीनोबायोटिक biotransformations की जांच, या ब्याज का एक नमूना से एक चयापचय प्रोफाइल पर कब्जा करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है. संकल्प और संवेदनशीलता उत्पन्न बड़े डेटासेट के स?…
The authors have nothing to disclose.
हम एनआईएच अनुदान P30ES013508 और 5T32GM008076 के समर्थन को स्वीकार करते हैं. हम भी चलनी 2.0 और डीआरएस के उपयोग के लिए थर्मो वैज्ञानिक धन्यवाद. उपयोगी विचार विमर्श के लिए यूजीन Ciccimaro और थर्मो वैज्ञानिक के मार्क सैंडर्स.
Reagent | |||
Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
Equipment | |||
High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |