En<em> Caenorhabditis elegans</em> Modell System for Amylopathy Study

Summary

Vi beskriver metoder for å studere aspekter av amylopathies i ormen<em> C. elegans</em>. Vi viser hvordan du kan lage ormer uttrykker menneskelig Aβ₄₂ I nevroner og hvordan du kan teste deres funksjon i atferdsmessige analyser. Vi viser videre hvordan man skal oppnå primære nevronale kulturer som kan brukes for farmakologisk testing.

Abstract

Amylopathy er et begrep som beskriver unormal syntese og akkumulering av amyloid beta (Aβ) i vev med tiden. Aβ er et kjennetegn på Alzheimers sykdom (AD) og finnes i Lewy legeme demens, inkludering kropp myositt og cerebral amyloid angiopathy ^1-4. Amylopathies gradvis utvikle seg med tiden. Av denne grunn enkle organismer med korte livsløp kan bidra til å belyse molekylære aspekter av disse forholdene. Her beskriver vi eksperimentelle protokoller for å studere Aβ-mediert neurodegeneration hjelp ormen Caenorhabditis elegans. Dermed konstruerer vi transgene ormer ved å injisere DNA koder for human Aβ ₄₂ inn i syncytial gonader av voksne hermafroditter. Transformant linjer er stabilisert av en mutagenese-indusert integrering. Nematoder er alder synkronisert ved å samle og såing sine egg. Funksjonen av nevroner uttrykker Aβ ₄₂ er testet i beleilige atferds-analyser (kjemotaksis analysene). Primære nevrale kulturer hentet fra embryoer blir brukt til å utfylle atferdsmessige data og for å teste de nervecellene effekter av anti-apoptotiske forbindelser.

Introduction

Amyloid beta (Aβ) er et peptid med 36-43 aminosyrer som er dannet etter sekvensiell spalting av amyloid forløper protein (APP) med β og γ secretases ^en. Den γ sekretaselignende behandler den C-terminale ende av peptidet Aβ og er ansvarlig for dets variable lengder ^5. De vanligste formene for Aβ er Aβ ₄₀ og Aβ _42, sistnevnte blir oftere assosiert til patologiske tilstander som AD ^fem. Ved høye konsentrasjoner Aβ danner β-ark som samlet for å danne amyloid fibriller ^seks. Fibriller innskudd er den viktigste komponenten i senile plakk rundt nerveceller. Begge plaketter og diffusible, ikke-plakk Aβ oligomers, antas å utgjøre de underliggende sykdomsfremkallende former for Aβ.

Laboratory studie av neuronal amylopathies er komplisert ved det faktum at disse forholdene fremgang med tiden. Derfor er det important å utvikle genetisk medgjørlig dyremodeller-komplementær til mus-med kort levetid. Disse modellene kan brukes til å belyse spesifikke aspekter ved amylopathies-typisk cellulært og molekylært-og i kraft av sin enkelhet, bidra til å fange essensen av problemet. Ormen Caenorhabditis elegans fall er denne kategorien. Den har en kort levetid, ~ 20 dager og i tillegg grunnleggende cellulære prosesser, inkludert regulering av genekspresjon, protein trafficking, neuronal tilkobling, synaptogenesis, celle signalisering og død er lik pattedyr ^7. Unike trekk ved orm omfatter kraftige genetikk og mangel på et fartøy system, som gjør det mulig å studere neuronal skade uavhengig av vaskulær skade. På den annen side begrenser mangelen på et hjerne bruk av C. elegans til å studere mange sider av neurodegeneration. I tillegg kan den reproduksjon og identifisering av anatomiske fordelinger av lesjonene ikke utføres i denne organisme. Andre rettningslinjersjoner inkluderer problemer med å vurdere både forskjeller i genekspresjonsprofiler og nedskrivning av kompleks atferd og minnefunksjon. Her beskriver vi metoder for å generere C. elegans modeller av amylopathies.

Protocol

En. Bygging av transgene Worms Transformasjon. Forbered injeksjon pads. Plasser en dråpe varm, 2% agarose oppløst i vann, på en glass dekkglass. Raskt plassere en andre dekkglass på slipp og lett trykk på det. Etter at agarosen er størknet, slide dekkglass fra hverandre, og bake dekkglass-matte i en vakuumovn ved 80 ° CO / N. Trekk pipetter. Vi bruker en Sutter P-97 avtrekker for å trekke 1/0.5 mm OD / ID borosilikat kapillærer med glødetråd. Pipetter er smidd med lukket tips som…

Representative Results

Med våre protokoller studerer vi effekter av menneskelig Aβ 42 oligomeren på nervecellefunksjon åtte. Et fragment koding menneskelig Aβ 42 og den kunstige signal peptid kodende sekvens av Brann vektor pPD50.52 ble forsterket fra konstruksjon PCL12 ni bruke primere som introduserte en Sma en restriksjonsendonuklease nettsted på endene. Fragmentet ble deretter satt inn i en konstruksjon som inneholder et 2481-bp FLP-6 promotersekvens i pPD95.75 Brann vektoren mell…

Discussion

Her beskriver vi en kombinert tilnærming, for å studere cellulære og molekylære aspekter av amylopathies hjelp C. elegans. Fordelene ved denne metode er: 1). Lav kostnad C.elegans opprettholdes i normal petriskål podet med bakterier, ved romtemperatur. 2) Kraftige genetikk. Transgene dyr kan bli oppnådd i få måneder, og et bredt utvalg av promotor-sekvenser er tilgjengelig for å drive ekspresjon av det ønskede gen i bestemte nerveceller. 3) Enkle, godt karakterisert, nervesystemet. C. ele…

Materials

Name of Reagent	Company	Catalog Number	Comments
			1. NGM
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886	3 g
Bacteriological agar	AMRESCO	J637	17 g
Bacto-peptone	AMRESCO	J636	2.5 g
Distilled Water			Bring to 975 ml
			Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml of 1 M stock
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C5670	1 ml of 1 M stock
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C3045	1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol)
Potassium phosphate buffer			25 ml of 1M stock
			2. Potassium phosphate buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655	108.3 g
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786	35.6 g
Distilled Water			Bring to 1 L
			Sterilized by autoclaving
			3. M9 buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655	3 g
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S5136	6 g
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886	5 g
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml of 1 M stock
Distilled Water			Bring to 1 L
			Sterilized by autoclaving
			4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm)
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886	118 mM
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5405	48 mM
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C5670	2 mM
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M4880	2 mM
HEPES	Fisher Scientific	BP310	25 mM
Distilled Water			Bring to 1 L
			Sterilized by autoclaving
			5. CM-15
L-15 culture medium	Gibco	11415	450 ml
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437-028	50 ml
Penicillin	Gibco	15140	50 units/ml
Streptomycin	Gibco	15140	50 g/ml
			Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C
			6. Other Reagents
Halocarbon 700 oil	Halocarbon Products	9002-83-9
5 μm Acrodisc Syringe Filter	PALL Co.	4199
Chitinase	Sigma-Aldrich	C6137-5UN
Lectin (peanut)	Sigma-Aldrich	L0881-10MG
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S320
Lysine	Sigma-Aldrich	L5501
Biotin	Sigma-Aldrich	B4639
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	425044
Sodium azide	Sigma-Aldrich	71289
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389