Mekanisk Stimulation-induceret Calcium bølgeudbredelse i cellemonolag: eksempel med Bovin hornhindeendothelceller

Summary

Intercellulære Ca^{2 +}-Bølger er drevet af gap junction-kanaler og hemichannels. Her beskriver vi en metode til måling intercellulære Ca^{2 +}-Bølger i cellemonolag som reaktion på en lokal encellede mekanisk stimulus og dens anvendelse til at undersøge de egenskaber og regulering af gap junction-kanaler og hemichannels.

Abstract

Intercellulære kommunikation er afgørende for koordineringen af ​​fysiologiske processer mellem celler i en række forskellige organer og væv, herunder hjernen, lever, nethinde, cochlea og kar. I eksperimentelle indstillinger ^+-bølger intercellulære ^Ca2 kan fremkaldes ved at anvende en mekanisk stimulus til en enkelt celle. Dette fører til frigivelse af de intracellulære signalmolekyler IP ₃ og Ca ^{2 +,} der indleder udbredelsen af Ca ^{2 +-bølge} koncentrisk fra mekanisk stimuleret celle til de omkringliggende celler. De vigtigste molekylære veje, der styrer intercellulære Ca ^{2 +-bølgeudbredelse} leveres af gap junction-kanaler gennem direkte overførsel af IP _3, og ved hemichannels gennem udgivelsen af ATP. Identifikation og karakterisering af ejendommene og regulering af de forskellige connexin og pannexin isoformer som gap junction-kanaler og hemichannels er tilladt af quantification af spredningen af det intercellulære ^{Ca2 +-bølge,} siRNA, og anvendelsen af inhibitorer af gap junction-kanaler og hemichannels. Her beskriver vi en metode til at måle intercellulære ^{Ca2 +-bølge} i monolag af primære hornhindeendothelceller læsset med Fluo4-AM i respons på en kontrolleret og lokaliseret mekaniske stimuli provokeret af en akut, kortvarigt deformation af cellen som et resultat for at røre cellemembranen med en mikromanipulator-kontrolleret glas mikropipette med en spids diameter på mindre end 1 um. Vi beskriver også den isolering af primære bovine hornhindeendothelceller og dens anvendelse som model system til at vurdere Cx43-hemichannel aktivitet som den drevne kraft intercellulære ^{Ca2 +-bølger} gennem frigivelse af ATP. Endelig diskuterer vi brug fordele, begrænsninger og alternativer ved denne metode i forbindelse med gap junction kanal og hemichannel forskning.

Introduction

Intercellulære kommunikation og signalering er afgørende for koordineringen af fysiologiske processer som reaktion på ekstracellulære agonister på vævet og hel-orgel niveau ^1,2. Den mest direkte måde intercellulære kommunikation er skabt af forekomsten af ​​gap junctions. Gap junctions er platter gap junction-kanaler, som er proteinholdige kanaler dannet af head-to-head docking af to connexin (Cx) hemichannels af tilstødende celler ^3,4 (Figur 1). Gap junctions tillader passage af små signalmolekyler med en molekylvægt på mindre end 1,5 kDa, herunder ^{Ca2 +} eller IP ₃ ^5, forårsager og modulerende ^{Ca2 +-frigivelse} fra intracellulære lagre af nabocellerne ⁶ (figur 2). Gap junction kanaler er stramt reguleret af intra-og intermolekylære proteininteraktioner og cellulære signalering processer som redox modifikation ogfosforylering ^7.. GJS lette koordineret reaktion af tilsluttede celler og dermed handle som en kemisk og elektrisk syncytium. For eksempel er udbredelsen af hjertets handling potentiale på tværs af de atrielle og ventrikulære myocytter medieret af CX-baserede GJ kanaler ^85. Cxs ikke kun har en rolle som gap junction-kanaler, men også danne uparrede hemichannels, derved fungerer som kanaler i membraner samme regelmæssige ionkanaler ^8-10 (figur 1). Hemichannels deltager i parakrine signalering mellem naboceller ved at styre udveksling af ioner og signalmolekyler mellem intra-og ekstracellulære miljø.

I mange celletyper (som epitelceller, osteoblastiske celler, astrocytter, endotelceller, etc.) og organer (som hjerne, lever, nethinde, cochlea og kar), ^+-bølger intercellulære ^Ca2 er fundamentale for koordineringen af flercellede svar <sup> 11.. Stigninger i intracellulære ^{Ca2 +-niveauer} i en bestemt celle er ikke begrænset til denne celle, men forplante sig til de omgivende naboceller, hvorved der etableres et intercellulært ^{Ca2 +-bølge 12,13.} Disse intercellulære ^{Ca2 +-bølger} er vigtig for normal fysiologisk regulering af cellelag som et syncytium og deres dysregulation er blevet forbundet med patofysiologiske processer ^11. I hornhindeendothelet og epitelet, studerede forskellige grupper ^14-24, herunder vores egen ^25-33, mekanismerne og roller intercellulære kommunikation. I ikke-exciterbare celler, ligesom hornhindeendothelceller to forskellige former for intercellulær kommunikation forekommer ^28,29, nemlig kløften forbindelsesepitop intercellulær kommunikation og parakrine intercellulær kommunikation. Gap forbindelsesepitop intercellulære kommunikation indebærer en direkte udveksling af signalmolekyler via mellemrumssammenføjninger ^7.. Gap junctionale intercellulære kommunikation er afgørende for at opretholde vævshomeostase, kontrollerende celledeling, og etablere en synkroniseret reaktion på ekstracellulær stress ^10,34,35. I en række patologier er gap junction kobling reduceret på grund af defekte cxs og hermed påvirke kløft forbindelsesepitop intercellulære kommunikation ^36.. Dette understreger vigtigheden og indflydelse kløften forbindelsesepitop intercellulære kommunikation i flercellede organismer. I modsætning til kampen forbindelsesepitop intercellulær kommunikation, er paracrine intercellulær kommunikation ikke afhængig af celle-celle anbringelsen, idet det indebærer frigivelse af diffunderbare ekstracellulære budbringere (figur 2). Forskellige typer af signalstoffer frigives i det ekstracellulære rum ved at signalere celler. Molekylet er derefter transporteres til målcellen hvor det er detekteret af en specifik receptor-protein. Efterfølgende receptor-signal kompleks inducerer et cellulært respons, derafsluttes ved fjernelse af signalet, inaktivering eller desensibilisering. Frigivet lipofile ekstracellulære signalering budbringere trænge membranen og handle på intracellulære receptorer. I modsætning hertil hydrofile budbringere ikke krydse plasmamembranen af ​​den responderende celle, men fungerer som en ligand, som binder til overflade-udtrykte receptorproteiner, som derefter videresender signalet til det intracellulære miljø. Tre store familier af celleoverfladereceptor proteiner deltager i denne proces: ionkanal-forbundet, enzymbundet, og G-protein-bundet. Den frigivne messenger molekyle kan handle på receptorer af samme celle (autokrin), på målceller i umiddelbar nærhed (paracrine), eller på fjerne målceller, der kræver kredsløbssygdomme (endokrine).

I mange celletyper, herunder hornhindeendothelet ^28,29, er ATP en af de større hydrofile, parakrine faktorer, som driver udbredelsen af intercellulære ^{Ca2 +-bølger 37-40.} During mekanisk deformation, hypoxi, betændelse eller stimulering af forskellige agenter, kan ATP frigøres fra raske celler ^41-44 reaktion på forskydningsspænding, stræk, eller osmotisk hævelse ^44,45. Forskellige ATP-frigivelse mekanismer er blevet postuleret, herunder vesikulær exocytose ⁴⁴ og en overflod af transportmekanismer, såsom ATP-bindende kassette (ABC) transportere, plasmalemmal spændingsafhængige anion kanaler ^46, P2X7 receptor kanaler ^47,48, samt connexin hemichannels ^49-52 og pannexin hemichannels ^43,49,53. Ekstracellulær ATP kan være hurtigt hydrolyseres til ADP, AMP og adenosin ^54,55 af ectonucleotidases der er til stede i det ekstracellulære miljø. Den ekstracellulært udgivet ATP og dets metabolit ADP ⁵⁶ vil spredes via diffusion. Den efterfølgende vekselvirkning af disse nukleotider med purinerge receptorer i de omkringliggende celler har været impliceret i propagation af intercellulære ^{Ca2 +-bølger 28,37,51.} To forskellige klasser af purinerge receptorer findes: adenosin er den vigtigste naturlige ligand for P1-purinreceptorer, mens både purin (ATP, ADP) og pyrimidin (UTP, UDP) nukleotider handle på de fleste P2-purinreceptorer ^57.

Intercellulære kommunikation kan undersøges ved forskellige metoder såsom skrabe lastning, dye transfer, lokal uncaging af agonister som IP ₃ og Ca ^{2 +,} mekanisk stimulering, etc.. Her beskriver vi studiet af Ca ^{2 +-bølgeudbredelse} fremkaldes ved mekanisk stimulering af en enkelt celle. Fordelen ved at studere Ca ^{2 +-bølgeudbredelse} ved mekanisk stimulering er, at det giver en let værktøj til at kvantificere udbredelsen af Ca ^{2 +-bølge} over tid, og det giver kvantitativt at sammenligne forskellige forbehandlinger af cellerne. I hornhindeendothelet, ^+-bølger disse intercellulære ^Ca2 tillader en cokoordineret reaktion fra monolaget, herved fungerer som en mulig forsvarsmekanisme af den ikke-regenererende hornhindeendothelet hjælper endothelium at modstå ekstracellulære belastninger under intraokulær kirurgi, eller ved udsættelse for inflammatoriske mediatorer under immunafvisning eller uveitis ^58,59.

Protocol

1.. Isolering af hornhindeendothelceller Før du går i gang: Isoler celler fra friske øjne, opnået fra en lokal slagteri, så snart som muligt efter enucleating øjet. Sørg for, at øjet blev udskrællet fra en ko af de maksimalt 18 måneder, fem minutter efter slagtning og bevaret i Earle Balanced Salt Solution – 1% jodopløsning ved 4 ° C for transport til laboratoriet. Tag øjet ud af Earle Balanced Salt Solution – 1% jodopløsning og placere den i en petriskål (100 x 20 …

Representative Results

Alle forsøg udføres i overensstemmelse med alle relevante retningslinjer, bestemmelser og reguleringsorganer og protokollen bliver demonstreret udføres under vejledning og godkendelse af dyret pleje og brug udvalg af KU Leuven. Hos kvæg hornhindeendothelceller (BCEC), er funktionelle gap junctions udtrykt og begge kløften forbindelsesepitop intercellulær kommunikation og paracrine intercellulær kommunikation bidrage væsentligt til intercellulær kommunikation på en interaktiv måde,…

Discussion

I dette manuskript, beskriver vi en simpel metode til at måle intercellulære ^{Ca2 +-bølgeudbredelse} i monolag af primære bovine hornhindeendotelceller ved at tilvejebringe en lokaliseret og kontrolleret mekanisk stimulering ved hjælp af en mikropipette. Mekanisk stimulerede celler reagere med en lokal stigning i intracellulær _IP3 og ^{Ca2 +,} som begge er vigtige intracellulære signalmolekyler, der driver intercellulære ^{Ca2 +-bølgeudbredelse 11,67.} IP ₃ direkte…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Column1
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14155-048
Iodine	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	38060-1EA
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	11960-044
L-glutamine (Glutamax)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	35050-038
Amphotericin-B	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A2942
Antibiotic-antimycotic mixture	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	15240-096
Trypsin	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	25300-054
Dulbecco’s PBS	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14190-091
Fluo-4 AM	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	F14217
ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP)	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A265
Apyrase VI	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6410
Apyrase VII	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR)	Custom peptide synthesis
Gap27 (SRPTEKTIFII)	Custom peptide synthesis
Control Peptide (SRGGEKNVFIV)	Custom peptide synthesis
siRNA1 Cx43 (sense: 5’GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA2 Cx43 (sense: 5’CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5’GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, Germany)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, Germany)
Two chambered glass slides	Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)	155380
Confocal microscope	Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)	LSM510
Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	P-280
HVPZT-amplifier	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	E463 HVPZT-amplifier
Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)	World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA	4878
Microelectrode puller	Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)	WZ DMZ-Universal Puller