Method Article

Whole Cell Patch-Clamp für erforschen die Mechanismen der Infrarot Neural Stimulation

DOI:

10.3791/50444

⸱

July 31st, 2013

 ,  ,  , 
1Biotactical Engineering, Faculty of Engineering and Industrial Science, Swinburne University of Technology, 2Department of Otolaryngology, The University of Melbourne

In This Article

Summary

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Infrarot Nervenstimulation als Alternative, eine elektrische Stimulation in einem Bereich von Nerven-Typen, einschließlich derjenigen mit auditorischen System zugeordnet vorgeschlagen. Dieses Protokoll wird ein Patch-Clamp-Verfahren zur Untersuchung des Mechanismus der Infrarot Nervenstimulation in einer Kultur von primären auditorischen Nervenzellen.

Abstract

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Es hat sich in den letzten Jahren gezeigt, dass gepulste Infrarot-Laserlicht verwendet werden, um elektrische Reaktionen in neuronalen Gewebe hervorzurufen, unabhängig von einer weiteren Abwandlung der Zielgewebe. Infrarot neuronale Stimulation in einer Vielzahl von peripheren und sensorischen neuronalen Gewebe wurde in vivo angegeben, wobei besonderes Interesse an der Stimulation der Nervenzellen im auditorischen Nervenzellen gezeigt. Während jedoch INS gezeigt wurde, dass in diesen Einstellungen funktionieren, ist der Mechanismus (oder Mechanismen), durch die Infrarot-Licht bewirkt neuronalen Erregung momentan nicht gut verstanden. Das Protokoll hier beschreibt eine ganze Zelle Patch-Clamp-Methode entwickelt, um die Untersuchung von Infrarot neuronale Stimulation in kultivierten primären auditorischen Neuronen zu erleichtern. Durch gründliches Charakterisierung der Reaktion dieser Zellen auf Infrarot-Laserbelichtung in vitro unter kontrollierten Bedingungen kann es möglich sein, ein verbessertes Verständnis der grundlegenden Physica gewinnenl und biochemischen Prozessen zugrunde liegenden neuronalen Infrarot-Stimulation.

Introduction

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Die Felder der Neurophysiologie und medizinischen Bionik verlassen sich stark auf Techniken, die steuerbare elektrische Stimulation der Antworten in Nervengewebe zu ermöglichen. Während elektrische Stimulation bleibt der Goldstandard in der neuronalen Erregung, leidet es an einer Reihe von Nachteilen wie das Vorhandensein der Stimulation Artefakte bei der Aufzeichnung neuronalen Antworten und einen Mangel an Stimulation Spezifität aufgrund der Ausbreitung von Strom in das umliegende Gewebe ein.

Die letzten zwei Jahrzehnte haben die Entwicklung von optisch vermittelten Stimulation Techniken 2 zu sehen. Einige dieser T....

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Protocol

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1. Kultur von Spiral Ganglionneuronen

  1. Sterilisieren kleinen runden (z. B. 10 mm Durchmesser) Deckgläschen und gebogenen Pinzette in einem Autoklaven. Übertragen Sie die sterilisierten Deckgläschen in einzelne Vertiefungen einer sterilen 4-Ring 35 mm Petrischale oder 4-Well-Platte mit den sterilisierten Pinzette. Bewerben 150 ul von Poly-L-Ornithin (500 ug / ml) und Mauslaminin (0,01 mg / ml) auf die Oberseite des Deckglases und in einen Inkubator (37 ° C) für bis zu 48 Stunden. Stellen Sie sicher, dass die Deckgläser schwimmen nicht weg von dem Boden des Bohrlochs.
  2. Planen 50 ml sterile Neurobasal Medien (NBM) für jedes neuronale Kultur: ....

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Results

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Spiral Ganglionneuronen auf Laserbeleuchtung reagieren mit wiederholbaren Wellenformen sowohl Voltage-Clamp-und Strom-Clamp-Aufnahme-Konfigurationen. 3a zeigt typische Änderungen des Stromflusses durch eine Zellmembran in Antwort auf eine 2,5 ms, 0,8 mJ Laserpuls (durchschnittliche Reaktionszeit von 6 Laserpulse, bei 1 sec Intervallen) mit dem Membranpotential bei -70 mV, -60 mV und -50 mV gehalten wiederholt. Net Einwärtsströme konsequent in Reaktion auf Laserpulse hervorgerufen, Rückkehr zu Ausgangswe.......

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Discussion

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Mit den Protokollen vorliegenden Ausführungen ist es möglich, zu extrahieren und Kultur Spiralganglienzellen Neuronen und Laser-evozierte elektrische Aktivität durch Ausführen Ganzzell Patch-Clamp-Experimenten untersucht. Bei in vitro verwendet werden, bietet der Patch-Clamp-Verfahren eine Stufe der Kontrolle über die experimentellen Parameter, die nicht in vivo zu erreichen ist. Laser Stimulationsparameter wie Wellenlänge, Pulsenergie, Pulslänge, Pulsform und Impulsfolgefrequenz Sequenzen können in ei.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde vom Australian Research Council unter Linkage Projektstipendium LP120100264 unterstützt.

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Materials

Extrazelluläre Lösung td colspan="4">Tabelle 2. Lösungen für Zellkulturen und Patch-Clamps. a) Neurobasale Medien. b) Intrazelluläre Lösung. c) Extrazelluläre Lösung.Patch-Clamp-Verstärkertd colspan="4">Table 3.Patch clamp Ausrüstung. für optische Fasern wird

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Zellkulturmaterialien und -ausrüstung
Deckgläser aus GlasLomb ScientificCSC 10 1 GP
4-Ring-Zellkulturschale VWR International82050-542
Poly-L-Ornithin-LösungSigma-AldrichP4957
LamininInvitrogen23017-015
Gebogen PinzetteWPI14101Dumont #5 Pinzette (45°; Winkelspitze)
CO2 InkubatorThermoScientificHeracell 150i
Tabelle 1. Zellkulturmaterialien und -ausrüstung.
Neurobasal media
Neurobasal AGibco10888-022
N-2 SupplementInvitrogen17502-048
B27 serumfreies SupplementInvitrogen17504-044
Penicillin-StreptomycinInvitrogen15140-148
L-GlutaminInvitrogen25030-149
Intrazelluläre Lösung
KaliumchloridSigma-AldrichP4504
HEPESSigma-AldrichH4034
Kalium-D-GluconatSigma-AldrichG4500
EGTASigma-AldrichE3889
Na2ATPSigma-AldrichA2383
MgATPSigma-AldrichA9187
NaGTPSigma-AldrichG8877
KaliumhydroxidLabServBSPPL738.500
SaccharoseSigma-AldrichS8501<
NatriumchloridSigma-Aldrich310166
KaliumchloridSigma-AldrichP4504
HEPESSigma-AldrichH4034
CalciumchloridSigma-Aldrich383147
MagnesiumchloridSigma-AldrichM8266
D-GlukoseSigma-AldrichG8270
NatriumhydroxidLabServBSPSL740.500
SaccharoseSigma-AldrichS8501<
Aufrechtes MikroskopZeissAxioExaminerD1Ausgestattet mit Dodt Kontrast
Wasser-ImmersionsobjektivZeissW Plan-APOCHROMAT 40x/0.75
Plattform und X-Y-Tisch ThorLabsBurleigh Gibraltar
AufnahmekammerWarner InstrumentsRC-26G
SchwingungsisolationstischTMCMicro-g 63-532
CCD-KameraDiagnosegeräteRT1200
KamerasoftwareDiagnoseinstrumenteSPOT Basic
Inline-LösungsheizungWarnerSH-27B
TemperaturreglerWarnerTC-324B
Molecular DevicesMulticlamp 700B
Patch-Klemme DatenerfassungssystemMolecular DevicesDigidata 1440A
MikromanipulatorSutter InstrumentsMPC-325
MikropipettenglasSutter InstrumentsGBF100-58-15Borosilikatglas mit Filament
Mikropipette PullerSutter InstrumentsP2000
Recording SoftwareAxoGraphLab Pack und Elektrophysiologie-Werkzeuge
AspiratorflascheSigma-AldrichCLS12201L1 L Pyrex Aspiratorflasche, mit Auslass für Schläuche
PE SchläucheHarvardPolyE #340
Masterflex SchlauchpumpeCole-ParmerHV-07554-85<
1.870 nm LaserdiodeOptotech
200/220 &m; Multimode-Glasfaser-Patchkabel mit m Durchmesser (FC/PC)AFW TechnologiesMM1-FC2-200/220-5-C-0,22Lichtzufuhr-Glasfaser, Quarzglaskern und -ummantelung, 0,22 NA
Glasfaser-Durchgangsstecker (FC/PC)ThorlabsADAFC2
Glasfaser-SpalterEREMFO1
Abisolierwerkzeug für Glasfasern (0,25 - 0,6 mm) SiemensZum Entfernen des Glasfasermantels
Abisolierwerkzeug für optische Fasern (0,6 - 1,0 mm)SiemensZum Entfernen der Außenbeschichtung von Patchkabeln
SignalgeneratorJeder Signalgenerator, der die erforderlichen Impulsformen ausgeben kann und extern getriggert werden kann
StellungsreglerKundenspezifischer Positionierer. Kann durch einen Standard-Mikropositionierer ersetzt werden, der für Patch-Clamp-Experimente verwendet
Glasfaser-ChuckNewportFPH-DJ
Laser-Leistungsmesser undDetektorkopf CoherentFieldMate (Leistungsmesser) mit LM-3 (Detektorkopf)
Tabelle 4. Laserausrüstung.
td colspan="4">

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003(2005).
  2. Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical rad....

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Infrared Neural StimulationWhole Cell Patch ClampAuditory NeuronsSpiral Ganglion NeuronsLaser IrradiationPatch Clamp SetupOptical Fiber PositioningMembrane CapacitanceSeries Resistance CompensationCurrent Clamp Mode

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