Multi-modalitet billeddannelse er en værdifuld metode til at studere bakteriel kolonisering i små dyremodeller. Denne protokol skitserer infektion af mus med bioluminiscerende<em> Citrobacter rodentium</em> Og den langsgående overvågning af bakteriel kolonisering med komposit 3D diffust lys imaging tomografi med μCT billeddannelse for at skabe en 4D film på<em> C. rodentium</em> Infektion.
Denne protokol beskriver de nødvendige skridt til at længderetningen overvåge en bioluminescerende bakteriel infektion med komposit 3D diffust lys imaging tomografi med integreret μCT (DLIT-μCT), og den efterfølgende anvendelse af disse data til at generere en fire dimensional (4D) film af infektionen cyklus. At udvikle 4D infektion film, og at validere DLIT-μCT billeddannelse til bakteriel infektion undersøgelser ved hjælp af en IVIS Spectrum CT, vi brugte infektion med bioluminiscerende C. rodentium, som forårsager selvbegrænsende colitis hos mus. I denne protokol, skitsere vi infektion af mus med selvlysende C. rodentium og non-invasiv monitorering af kolonisering ved daglig DLIT-μCT billedbehandling og bakteriel tælling fra afføring i 8 dage.
Brugen af IVIS Spectrum CT letter problemfri co-registrering af optiske og μCT scanninger med en enkelt imaging platform. Den lave dosis μCT modalitet muliggør billeddannelse af muspå forskellige tidspunkter i løbet af infektion, der giver detaljeret anatomisk lokalisering af bioluminescerende bakteriel foci i 3D uden at forårsage artefakter fra den kumulative stråling. Vigtigere, 4D film af inficerede mus giver et kraftfuldt analytisk værktøj til at overvåge bakteriekolonisering dynamik in vivo.
Små dyremodeller, især de udnytter mus, anvendes rutinemæssigt til at undersøge bakteriel patogenese eller for at teste interventionsstrategier for infektioner, såsom antibiotika, probiotika, præbiotika og vacciner 1-7. De vigtigste eksperimentelle udlæsninger fra små dyr infektioner er patogen belastning, rumlig og tidsmæssig lokalisering af infektionen, og ændringer i immunresponset af inficerede organisme. In vivo optisk billeddannelse er et værdifuldt redskab til infektionssygdomme forskning og kan bruges til at overvåge flere eksperimentelle aflæsning ved brug af reportergener (luciferase, fluorescerende proteiner, beta-lactamase, etc.), fluorescerende farvestoffer, nanopartikler eller kemiluminescerende prober rettet mod et protein, biologisk proces, eller mikroorganisme 6..
Bioluminescens imaging (BLI) er en optisk afbildningsmodalitet anvendes til at overvåge koloniseringen af små dyr, såsom mus og rotter, med patogene bakterieria 3,6,8,9. Mus inficeret med rekombinante bakterier, der udtrykker luciferase, såsom lux CDABE operonen fra Photorhabdus luminescens. Disse bakterier kan derefter påvises gennem deres lysproduktion ved hjælp af en CCD baseret in vivo imaging system 3,6,9. Vigtigere er det kun metabolisk aktive mikroorganismer er bioluminescerende (BL), hvilket kun levedygtige bakterieceller påvises ved denne metode 10,11. Ved hjælp af 2D BLI, placeringen af BL kilde udledes fra overfladen af dyret, hvor signalet udsendes 8.. Den nøjagtige anatomiske lokalisering af BL foci in vivo skal bestemmes gennem ex vivo analyse af organer 3,6,9 kan derimod sammensatte 3D diffust lys imaging tomografi (DLIT) blive brugt til at udarbejde en kvantitativ 3D rekonstruktion af BL kilde 12. DLIT udføres ved at indsamle BL taget billeder med definerede smalle band-pass optiske filtre ogefterfølgende indlæst dem i en diffus optisk tomografi 3D rekonstruktion algoritme 1,7,12,13.
I øjeblikket kombiterapi billeddannelse er den eneste metode til rådighed til at få ægte non-invasiv anatomisk lokalisering af bioluminescerende foci in vivo uden behov for ex vivo-analyse. For nylig brugte vi en kombination af DLIT co-registrerede med μCT imaging at evaluere Citrobacter rodentium (C. rodentium) kolonisering dynamik efter profylaktisk behandling med en probiotisk bakterie 7.. C. rodentium er en murin specifik enterisk patogen bruges til at modellere menneskelig infektion med enteropatogene og enterhemorrhagic Escherichia coli 14. C. rodentium infektion forårsager colitis, typisk forbundet med mild vægttab, diarré, polariseret Th1 immunrespons og distinkte patologiske forandringer, herunder colon krypt hyperplasi og fastgørelse og effacing læsion formati14.. Ud over dette, C. rodentium patogenese er blevet grundigt undersøgt ved hjælp af BLI og dets kolonisering dynamik i C57BL/6J-mus er veldokumenteret, hvilket gør denne bakterie en ideel model mikroorganisme til brug med multimodalitet billeddannelse 3,4,7.
Denne protokol er den første til at skitsere en metode til integreret DLIT-μCT billeddannelse af en bakteriel infektion ved hjælp af en enkelt multimodalitet billeddannelse platform, IVIS Spectrum CT, og frembringelsen af en 4D film viser den sande dynamik denne infektion non-invasivt.
4D film for bakteriel infektion giver et nyttigt værktøj til at visualisere og fortolke store mængder af multi-modalitet billeddata hurtigt og nemt. Denne teknik gør det lettere at detaljeret analyse af, hvordan en infektion spredes gennem en individuel mus og kan bruges til at undersøge, hvordan sletning af vært eller bakterielle gener eller særlige indgreb strategier effekt bakteriemængde, distribution og lokalisering i løbet af en forløbsundersøgelse 7.. Disse videoer giver også nyttige undervisningsmidler og et middel formidling af oplysninger til offentligheden.
Der er flere kritiske trin i denne protokol, der kan påvirke kvaliteten af oplysningerne fra DLIT-μCT imaging og evnen til at udarbejde en 4D video af infektion. Den vigtigste del af denne protokol er den vellykket og homogen infektion af mus med C. rodentium. Det er vigtigt, at de anvendte mus til undersøgelsen er mellem 18-20 g, og at bakterierial inoculums er frisklavet og cirka 5 x 10 9 cfu, som beskrevet tidligere 2,3. Før infektion af musene er det vigtigt at kontrollere, at inokulum bioluminescerende hjælp Spectrum CT og når podestoffet er fremstillet, skal det kontinuerligt homogeniseres før hver mus sondeernæret at sikre, at musene modtager lignende infektiøse doser. Den DLIT-μCT billeddannelse af mus er blevet optimeret, så den automatiske eksponering funktion i Living Billede 4.3.1 software bestemmer automatisk de optimerede imaging parametre for signalet til at være et godt stykke over støjen. Men auto eksponering funktion er betinget af brugerdefinerede indstillinger og parametre, der skal ændres, som beskrevet i proceduren. Undladelse af at gøre dette vil resultere i dårlige billeder med et lavt antal fotoner indsamlet som ikke resulterer i en indlysende progression i infektionen, da Spectrum CT fabriksindstillinger for AE er programmeret til billeddannelse tumorer udtrykkerildflueluciferase. Rekonstruktioner udføres ved hjælp af 560-620 nm give den bedste aftale mellem simulerede og målte data, og derfor er de mere pålidelige data til at omfatte i genopbygningen.
En begrænsning for anvendelsen af DLIT-μCT er, at ioniserende stråling fra μCT scanning medfører subletale stråleskader, der er kumulativ over en forløbsundersøgelse 18. Subletale bestråling kan svække immunforsvaret, forårsager DNA-skader, og apoptose i indre organer 19. I sidste ende kan kumulativ subletal stråleskader medføre døden, hvis LD 50/30 for ioniserende stråling overskrides, som er mellem 5 til 7 Gy afhængigt af musestamme og alder af musene anvendte 18,20,21. Selv om nogle af den molekylære skader fra ioniserende stråling kan helbrede, da det overordnede princip er at estimere dosis konservativt, er dette ikke typisk tegnede sig for i studie planlægning. I stedet er målet at holde sig så langt below disse grænser som muligt, mens du stadig varetagelse undersøgelsens mål. Dette er særligt vigtigt i denne undersøgelse, fordi den normale immunrespons på infektion, kan hyppigheden af billedbehandling, og at transgene, immuno-omfattede, eller stærkt inficeret dyr være mere modtagelige for ioniserende stråling.
Ved planlægning af eksperimentet til at generere en 4D film af infektion, er det vigtigt at overveje længden af eksperimentet, antallet af μCT scanninger nødvendig i denne periode, og LD 50/30 for ioniserende stråling til musestamme, der anvendes. En anden potentiel begrænsning til DLIT-μCT er styrken af reporter ekspression i den bakterielle stamme, der anvendes, da dette vil påvirke bakterielle detektionsgrænser og billedbehandling gange. Det anbefales stærkt, at forskere bruger valideret bakteriestammer, der er fuldt virulente, men optimeret til maksimal lux operon udtryk som demonstreret tidligere for BLI2,3.
En advarsel til den nuværende udformning af 4D billedbehandling er, at hver film består af individuelle DLIT-μCT scanninger, som har forskellig foton skalering. Dette kan gøre billederne svære at fortolke, om ændringerne i lokaliseringen af BL foci eller dens intensitet er subtile, eller hvis der er en intens BL fokus omgivet af flere svage brændpunkter. Derfor, for langsgående visualiseringer, er det vigtigt at holde farvelinjerne konsistent på tværs af tidspunkter.
Begrebet en 4D film af infektion kan anvendes på enhver passende mærket bakterielt patogen. Fremtidige udvikling af denne teknik vil sigte mod at bruge fluorescensimagografi tomografi (FLIT) samt DLIT at lette efterforskningen af værtsresponser for infektion ved hjælp af en kombination af bioluminiscerende bakterielle patogener og injicerbare fluorescerende nærinfrarøde sonder til at undersøge værtsresponser for infektion. Ud over dette, i denne protokol vi kunbeskriver anvendelsen af bioluminescerende bakterier til at skabe 4D film på infektion. Men i nogle tilfælde kan det være nødvendigt at anvende fluorescerende mærkede bakterier, for eksempel mærket med IRFP, således at bioluminescens reporteren kan anvendes til at undersøge host genetik under infektion. Vigtigere er det, vil brugen af multi-modalitet imaging kombinerer DLIT / FLIT-μCT tillade os at non-invasivt undersøge flere parametre i løbet af en bakteriel infektion, som vil bidrage væsentligt til reduktionen, forfining og erstatning af brugen af dyr til videnskabelig forskning som skitseret i NC3R initiativ ( http://www.nc3rs.org.uk/ ).
The authors have nothing to disclose.
In vivo imaging facilitet på Imperial College blev finansieret af MRC.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Bioluminescent C. rodentium | Frankel lab | ICC180 | Wiles et al., 2004 |
Veet | Boots | Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well. | |
Isofluorane (100% v/v) | Abbott | B506 | |
Medical Oxygen | BOC Medical | Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required. | |
Luria Bertani broth | Merck | 1.10285.0500 | 25 g in 1L Demineralised water. |
Luria Bertani agar | Merck | 1.10283.0500 | 37 g in 1L Demineralised water. |
Kanamycin sulphate | Sigma (Fluka) | 60615 | |
50 ml Polypropylene conical Falcon tubes | BD (Falcon) | 352070 | |
Universals | Corning (Gosselin) | E5633-063 | |
1 ml syringe | BD (Plastipak) | 300013 | |
Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved | Vet Tech | DE005 | |
Microbanks (Cryovial) | Pro-Lab Diagnostics | PL.170/Y | |
IVIS Spectrum CT | Caliper- a PerkinElmer Company | 133577 Rev A/ Spectrum CT | |
6kVA UPS | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
XGI-8 anesthesia system | Caliper- a PerkinElmer Company | 118918 | |
XAF-8 Anaesthesia filter charcoal | Caliper- a PerkinElmer Company | 118999/00 | |
Living Image v4.3.1 SP1 | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
Benchtop shaking incubator | New Brunswick Scientific | Innova 44 |