Transduction Adenoviral de CD4 naïfs cellules T pour étudier la différenciation Treg

Summary

Le transfert de gène adénoviral en CD4 des cellules T naïves avec expression transgénique du récepteur de l'adénovirus Coxsackie permet l'analyse moléculaire de la différenciation des cellules T régulatrices<em> In vitro</em>.

Abstract

Les cellules T régulatrices (Treg) sont essentielles pour assurer la tolérance immunitaire à l'auto ainsi que pour certains antigènes étrangers. Tregs peut être généré à partir de cellules T CD4 naïves in vitro avec le TCR et co-stimulation en présence de TGF et de l'IL-2. Cela porte un énorme potentiel pour de futurs traitements, cependant, les molécules et les voies de signalisation que la différenciation de contrôle sont largement inconnues.

Les cellules T primaires peuvent être manipulés par l'expression des gènes extra-utérine, mais les méthodes communes parviennent pas à cibler l'état naïf le plus important de la cellule T avant la reconnaissance de l'antigène primaire. Ici, nous fournissons un protocole d'exprimer des gènes extra-utérines en cellules T CD4 naïves in vitro avant d'induire la différenciation Treg. Elle s'applique transduction avec l'adénovirus déficient pour la réplication et explique sa génération et de la production. L'adénovirus peut prendre jusqu'à de grands inserts (jusqu'à 7 ko) et peut être équipé avec les promoteurs pour atteindre la haute et transitoire OVEREXPression dans les cellules T. Il transduit efficacement les lymphocytes T de souris naïves si elles expriment un récepteur de l'adénovirus Coxsackie transgénique (CAR). Surtout, après l'infection, les lymphocytes T restent naïfs (CD44 ^faible, CD62L ^élevé) et de repos (CD25 ^-, CD69 ^-) et peuvent être activées et différenciées en Tregs similaires aux cellules non-infectées. Ainsi, cette méthode permet la manipulation de cellules CD4 T différenciation cellulaire depuis ses débuts. Il assure que l'expression des gènes extra-utérine est déjà en place lorsque les événements de signalisation précoces de la stimulation initiale TCR induit des changements cellulaires qui aboutissent dans Treg différenciation.

Introduction

Tregs sont cruciales pour maintenir la tolérance immunitaire et à atténuer la réponse immunitaire de surréaction. Tregs supprimer l'activation des cellules T du spectateur. Par conséquent, l'ablation des Tregs conduit à l'auto-immunité fatal et l'auto-destruction entraînée par les cellules T activées ^1. Tregs se développent dans le thymus au cours de sélection négative des CD4 précurseurs mono-positifs, mais ils peuvent aussi faire la différence dans la périphérie de CD4 des lymphocytes T naïfs lors de la stimulation antigénique faible dose optimale avec ^1,2 co-stimulation. Thymique Tregs semblent supprimer l'auto-immunité tissu contre des auto-antigènes, alors que périphérique Tregs ont été impliqués dans la fourniture de tolérance dans l'intestin ou du poumon. Ceux-ci induit Tregs puissamment prévenir l'activation des lymphocytes T après la reconnaissance d'antigènes étrangers dans la muqueuse, y compris antigènes environnementaux de la nourriture et de l'air, les bactéries commensales, et les allergènes ^3,4. En outre, les Tregs sont essentielles pour établir la tolérance maternelle de peptides fœtales ⁵ et à prévent la maladie du greffon contre l'hôte ^6. Dans le même temps, Tregs également médier les effets indésirables en atténuant la surveillance immunitaire des cellules tumorales ^7,8. La fonction caractéristique de Tregs est l'expression de la sous-spécification transcription Foxp3 facteur, un facteur de transcription contenant un domaine fourche tête qui est nécessaire et suffisante pour conférer une fonction ^9,10 Treg. Certaines voies de signalisation qui peuvent induire l'expression de Foxp3 sont connus. Cependant, les mécanismes moléculaires qui contrôlent, réguler ou moduler Treg différenciation en réponse au récepteur des cellules T déclenchement sont moins bien compris.

Tregs peut être très efficace induite in vitro par la stimulation des cellules T CD4 naïfs avec des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 en présence de TGF et IL-2 ^11. Comme les Tregs émergents sont fonctionnelles in vivo, la manipulation de molécules qui favorisent la différenciation Treg porte un énorme potentiel pour l'avenir therapies, par exemple, le traitement de l'asthme, la maladie de Crohn et la transplantation ^11,12. Inversement, la modulation thérapeutique de molécules afin de bloquer la différenciation Treg peut offrir des avantages dans les futures approches de traitement combiné des patients atteints de tumeurs.

Dans les essais de différenciation in vitro ont joué un rôle important pour la description des changements moléculaires qui sont associés avec T différenciation de sous-ensemble de cellules. À l'heure actuelle, les tentatives expérimentales à la recherche ou à l'écran pour les produits de gènes qui contrôlent la différenciation des cellules T sont entravés par le fait que les méthodes les plus courantes de l'expression des gènes extra-utérine ne parviennent pas dans les cellules T naïves. Par exemple, l'électroporation et la transduction rétrovirale ne sont efficaces que dans les cellules T activées. Contrairement aux attentes initiales, la transduction lentivirus, qui est généralement efficace dans les cellules au repos, nécessite de pré-activation des cellules T naïves par des cytokines ^13. En outre, le transfert de l'ADNc ou de l'ARNm durant l'électroporationimplique une dépolarisation de la membrane plasmique, qui lui-même confère des caractéristiques de l'activation des cellules T et peut même mobiliser Ca ^{2 +} signalisation et activer des protéines NFAT (observation et ref inédit. ^14). De même, pour la transduction rétrovirale, les cellules T naïves doivent être activés pour 18 – 40 h. Pendant ce temps, la répartition de la membrane nucléaire au cours de la division cellulaire se produit et permet l'intégration de la génomique ultérieure du vecteur rétroviral ^15. Ces méthodes ne sont donc pas en mesure de répondre à la régulation moléculaire début de la rencontre initiale des lymphocytes T avec l'antigène, qui est la phase décisive de la différenciation des cellules T helper.

Transduction adénovirus est connue pour conférer une expression ectopique du gène passagère dans un certain nombre de types de cellules humaines qui expriment le récepteur de l'adénovirus humain Coxsackie (CAR). Il procède sans obligation pour l'activation de la cellule ou de la progression du cycle cellulaire. L'expression de surface de CAR est essentiel pour la fixation du virus efficace et l'intériorisation et l'expression transgénique de la version tronquée CARΔ1 sous un promoteur spécifique des cellules T a été trouvée pour rendre thymocytes de souris et des cellules T sensibles à l'infection par adénovirus ^16. Surtout, le transgène ne modifie pas le développement des thymocytes ou la différenciation in vitro des cellules CD4 T naïfs cellules dans différents sous-ensembles (données non présentées; ref ^17).. Transduction adénovirus des cellules T a déjà été utilisé pour la surexpression ^17,18 et knock-down approches ^19,20. Les cellules T transgéniques peuvent être purifiés à partir de commerce DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. et ref ^17).. Surtout, transduction adénovirale permet une haute expression d'un gène d'intérêt dans des cellules T naïves sans induire des signes évidents d'activation. Les lymphocytes T restent naïfs (CD44 ^faible, CD62L ^élevé) et de repos (CD25 ^-, CD69 ^-) après infectisur et peut être activée et différenciée en Treg similaire aux cellules non infectées.

Production d'adénovirus recombinants peut être atteint après transfection de cellules avec des plasmides HEK293A adénoviraux (Figure 1). Ces plasmides contiennent généralement du génome de l'adénovirus humain de type 5 avec les gènes E1 et E3 supprimées pour rendre adénovirus recombinants incompétent pour la réplication ^21. Cellules HEK293A complètent carence de réplication tels qu'ils ont été immortalisés par l'intégration stable de l'adénovirus ²² cisaillé. Depuis vecteurs adénoviraux sont grandes (~ 40 kb) et par conséquent pas bien adapté pour l'enzyme de restriction induite par clonage traditionnel, nous avons utilisé le système de passerelle. Le gène d'intérêt est initialement clonée dans un vecteur d'entrée plus petit, à partir de laquelle il peut être facilement transféré dans le vecteur adénoviral de destination par l'intermédiaire de la réaction de recombinaison lambda (LR) ^23. Nous avons construit le vecteur pCAGAdDuen associant le promoteur CAG (promoteur de l'actine de poulet et CMV) avec une cassette d'expression contenant des sites LR flanquant le marqueur de sélection ccdB procaryote ^24. Cette cassette d'expression est fusionnée à un site d'entrée interne du ribosome (IRES) de l'élément qui permet de co-expression du marqueur renforcée protéine eucaryote de l'infection fluorescente verte (EGFP), qui est fusionné à une séquence contenant l'hormone de croissance bovine poly (A) de signal. Nous avons choisi des séquences cis-régulatrices CAG, puisque le promoteur CMV prototype a été jugée hautement dépendant de l'activation et donc défavorable pour l'expression des gènes dans les cellules T naïves.

Ici, nous fournissons un protocole pour l'efficacité dans Treg différenciation in vitro et une méthode pour la transduction de CD4 des lymphocytes T naïfs sans activation (figure 2). La méthode permet l'expression des gènes extra-utérine ou abattre CD4 précédents différenciation des cellules T à l'état naïf. Il permet de tester l'effet d'une overexpressegène d 'intérêt au cours des événements de signalisation précoces lors de la stimulation initiale TCR jusqu'à engagement de sous-ensemble de cellules T. Nos expériences de validation fournissent également la base pour établir l'application de l'adénovirus similaire dans la différenciation des autres sous-ensembles de cellules T comme Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, ou des cellules TFH.

Protocol

1. Clonage d'un gène d'intérêt dans un vecteur d'entrée Cloner le gène d'intérêt dans un vecteur d'entrée. Amplification par PCR du gène suivie d'une ligature d'extrémités franches dans un vecteur topoisomérase couplé (par exemple pENTR / D-TOPO) ou l'enzyme de restriction à médiation par clonage peut être utilisé pour cette procédure. 2. Transfert du gène d'intérêt dans le pCAGAdDu Vecteur de Destination <o…

Representative Results

La production de virus Pour la production de titres élevés de virus, le moment de la récolte des cellules HEK293A dans la production primaire du virus ou d'amplification du virus est cruciale. Représentant images de contraste fluorescents et en phase avec les signes visuels de la production de virus sont présentés dans la figure 3. Le CPE a été observée 10 jours après transfection de cellules HEK293A avec un pCAGAdDu contrôle vectoriel sans insert. CPE sont carac…

Discussion

Génération Virus et titrage

Pour obtenir des résultats de transfection optimales, la qualité et la quantité de vecteur linéarisé semblent les plus importants. Nous n'avons pas observé d'effets négatifs sur la production de lysat primaire d'une prolifération initiale de la culture depuis l'infection va procéder rapidement une fois que la production de virus efficace se produit. Cependant, la production de virus par les cellules HEK293A peut être affectée par de longs…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K240020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	11791020
PacI	New England Biolabs	R057S
jetPEI	Polyplus-transfection	101-10N
HEK293A Cell Line	Invitrogen	R705-07
A549	ATCC	CCL-185
6-well plates	BD Falcon	353046
14 cm tissue culture dish	Nunc	168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr	Taconic Farms	Model Nr. 4285
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II	Miltenyi Biotech	130-094-131
DMEM	Invitrogen	41966-052
FBS	PAN Biotech	1502-P110704
PenStrep	Invitrogen	15140-122
RPMI 1640	Lonza	BE12-167F
NaPyruvate	Lonza	BE13-115E
NEAA 100x	Lonza	BE13-114E
L-Glutamine	Invitrogen	25030
HEPES Buffer Solution (1 M)	Invitrogen	15630-056
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M-7522
MEM Essential vitamin mixture (100x)	Lonza	13-607C
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation	Invitrogen	114-56D
Recombinant Human TGF-beta 1	R&D Systems	240B
Proleukin S (18 x 106IE)	Novartis
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L-23105
Mouse BD Fc BlockT	BD Pharmingen	553141
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE	eBioscience	12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay	Roche Applied Biosystems	4427975
LightCycler 480 Probes Master	Roche Applied Biosystems	04902343001
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Roche Applied Biosystems	4366596