縦用の眼の前房に移植、非侵襲<emインビボ></emリアルタイムでのシングルセル分解能>イメージング
Summary
眼内移植し、共焦点顕微鏡を組み合わせた新しいアプローチがグラフトされた組織内での単一セルの解像度で縦、非侵襲性のリアルタイムイメージングを可能にする<em生体内で></em>。我々は、マウスの眼の前房に膵島を移植する方法を示します。
Abstract
生体内イメージングは、生物学の研究に不可欠なツールとして浮上している。その過程で、多くのイメージング技術は、非侵襲的に動物に異なる生物学的過程を研究するために開発されてきた。しかし、既存の生体内イメージングモダリティの主要な技術的な限界は、単一セルの解像能力を持つ非侵襲的、縦画像を組み合わせることができないことである。我々は前眼房への移植は、 生体内で細胞レベルの分解能で非侵襲的な、縦撮影が可能多目的実験プラットフォームを提供するなどの重要な制限を回避する方法をここに示す。我々は、マウスに移植手順を示し、すなわち、臨床的意義、膵島移植でモデルを使用して代表的な結果を提供します。前眼房に移植し、様々な組織で直接可視化を可能にするだけでは、このアプローチはがれするためのプラットフォームを提供長期的なフォローアップを実施し、標的組織で監視することにより、n個の薬。なぜなら目の給付だけでなく、移植治療の前房にその汎用性、組織/細胞移植のために、それは、このようなシグナル伝達とがんや自己免疫疾患の発症などの生理学的および病態生理学的プロセスを研究するために 、in vivoアプリケーションで他にも及ぶ。
Introduction
生体顕微鏡の進歩は、in vitro試験1で予測されていない生理現象を明らかにした。これは、生きている動物にインビトロ法によって得られた従来の知見を翻訳に挑戦を強調しています。過去10年間では、生きた動物の組織の可視化はかなりの撮像モダリティ2、3、4、5、6の技術の進歩によって改善された。これは、非侵襲的に標的組織の縦可視化を可能にするための実験動物モデルで実現可能なアプリケーションを用いた in vivoイメージングアプローチのための必要性に拍車をかけている。
このような磁気共鳴イメージングと陽電子放射断層撮影法、または生物発光イメージング技術としては、体7-8、9の奥深くの臓器/組織の非侵襲的イメージングを有効にしている。しかし、これらの技術は使用Oにもかかわらず、高いバックグラウンド信号と低空間分解能に起因する単一細胞の解像度を達成することはできませんF高コントラスト材料または組織特異的発光4。これは二光子蛍光共焦点顕微鏡10の出現で対処されました。二光子顕微鏡は、前例のない詳細11、12と携帯電話のイベントを可視化し、定量化するために生体内イメージングの研究を可能にしました。これは、健康と病気13、14、15、16の重要な生物学的プロセスの特性評価につながっている。先駆的な生体内イメージング研究は、主に切除された組織（ 例えば、リンパ節） を用いたin vivo条件で "模倣"しているが、他の研究では 、in situ 17、18、19、20、21 に画像さらさ標的組織への侵襲的なアプローチを使用しています。他の研究でも侵襲的なアプローチおよび in vivo 22、23、24、25 に制限された撮像解像度に関連付けられた制限を回避するには、 "ウィンドウ室モデル"を使用しています。ウィンドウ室モデルでは、透明な窓を有する室は、外科的にdiffeで皮膚に注入される動物の家賃の場所（背や耳、皮膚、乳房脂肪、肝臓など）（ 例えば 、マウス、ラット、ウサギ）。このアプローチは明らかにin vivoイメージングの高解像度を可能にしますが、それは、チャンバを移植する侵襲的手術を必要とし、数週間または数ヶ月22の上に縦イメージング研究を収容することができない場合があります。
それが最近になって前眼房（ACE）への移植、すなわち、低侵襲で高解像度の共焦点顕微鏡法を組み合わせることで、in vivoイメージングプラットフォーム26,27 における強力で汎用性の高いような"自然な身体の窓"を提供している。実証されたACEへの移植は組織28、29、30の様々な生物学的側面 を研究するために、過去数十年で使用されてきた、そして高分解能イメージングとその最近の組み合わせにより、単一細胞の解像度で膵島の生理学を勉強して有効になって非侵襲的かつ長手方向に<> 26、27（商標）。このアプローチは、動物モデルにおける1型糖尿病（未発表データ）の開発の間に自己免疫応答を研究するために使用されました。また、それぞれのACE膵芽または個々の腎糸球体、（未発表データ）に移植することにより、腎機能の研究では、膵臓の発達を研究するだけでなく、ために使用された。このアプローチを使用した最近の報告書はさらに、膵島移植31日後の免疫応答を研究するための応用を実証しました。重要なのは、この研究では、眼の前房への移植は、実行する自然な身体のウィンドウを提供示した：in vivoで移植組織の（1）の長手方向の、非侵襲的イメージング、（2） 生体内でで 、細胞の表現型と生存率を評価するためにcytolabeling その場で 、標的組織で免疫細胞の浸潤（3）リアルタイム追跡、および局所適用または眼内注射によって（4）地元の介入。
ここでは、D膵島を用いて眼の前房に移植を行う方法emonstrate。
Protocol
Representative Results
Discussion
マウス膵島は、以前説明したように33、密度勾配上での精製に続くコラゲナーゼ消化を用いて単離した。孤立した膵島を移植する前に、一晩培養した。これは必要とされないかもしれないが、それは小島が単離手順から回復できるようにすることをお勧めします。これは、生き残った/堅牢な膵島の移植性を確保するように移植が糖尿病のレシピエントで実行される時に重要です。
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、博士を認める。カミッロリコルディ、アントネッロピレッジ、R.ダマリスMolano、ステファンSpeierと実りある議論のためのダニエルNyqvist。我々はまた、ビデオ録画のヘルプはEleutヘルナンデスとディエゴ·エスピノーサ-Heidmann技術支援のために、マイク·バルデスとマーガレットFormosoに感謝します。バイロンマルドナドは、編集された記録され、最終的な映像を作り出した。研究支援は、糖尿病研究所財団（提供されたwww.DiabetesResearch.org ）、NIH / NIDDK / NIAID（MHAにF32DK083226、ACへのNIH RO3DK075487; PO.B.へU01DK089538）。 PO.Bに追加の研究支援はカロリンスカ研究所、スウェーデン研究評議会、スウェーデン糖尿病財団、ファミリーErling Perssonさん、財団、ファミリークヌートとアリスウォレンバーグ財団、スカンディア·インシュアランス·カンパニー·リミテッド、活気のある（から資金を介して提供されましたFP7-228933から2）、カロリンスカ研における糖尿病における研究戦略推進プログラムitutet、ノボノルディスク財団、バースフォンKantzow財団。
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Description/Comments |
| IsoTHESIA (Isoflurane) | Buttler Animal Health Supply | 11695-6775-2 | 99.9% Isoflurane/ml |
| Ketaset (Ketamine HCL) | Fort dodge Animal Health | 0856-2013-01 | Alternative injectable anesthesia |
| Beprenex (Buprenorphine HCL) | Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd. | 12496-075-7-1 | 0.3 mg/ml |
| Erythromycin Ophthalmic Ointment USP, 0.5% | Akron | 17478-070-35 | Applied prophylactically to transplanted eye |
| 0.9% Sodium Chloride (Saline) | Hospira Inc. | 0409-7983-03 | For iv injection. Sterile |
| PBS | Gibco | 10010-023 | 1X. Sterile |
| CMRL medium 1066 | Cellgro | 98-304-CV | Supplemented, CIT modification. Preferred media for islets |
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