Transplantation ind i det forreste kammer i øjet til langsgående, ikke-invasiv<em> In vivo</em> Imaging med Single-celle Opløsning i realtid
Summary
En ny metode, der kombinerer intraokulær transplantation og konfokal mikroskopi muliggør langsgående, non-invasiv real-time scanning med encellede løsning inden podede væv<em> In vivo</em>. Vi viser, hvordan transplantere pancreasøer i forkammeret af muse øjet.
Abstract
Intravital billedbehandling har vist sig som et uundværligt værktøj i biologisk forskning. Ved fremgangsmåden har mange billeddannelsesteknikker blevet udviklet til at studere forskellige biologiske processer hos dyr ikke-invasivt. Men en stor teknisk begrænsning i eksisterende intravital billeddiagnostiske metoder er den manglende evne til at kombinere non-invasiv, langsgående billeddannelse med encellede opløsning kapaciteter. Vi viser her, hvordan transplantation ind i det forreste kammer i øjet omgår så væsentlig begrænsning giver en alsidig eksperimentel platform, der muliggør ikke-invasiv, langsgående billeddannelse med cellulær opløsning in vivo. Vi demonstrerer transplantation procedure i mus og giver repræsentative resultater ved anvendelse af en model med klinisk relevans, nemlig pancreasø transplantation. Ud over at muliggøre direkte visualisering i en række væv transplanteret ind i det forreste kammer i øjet, giver denne fremgangsmåde en platform til urenn lægemidler ved at udføre langsigtet opfølgning og kontrol i målvæv. Grund af dens alsidighed, vævs / celle transplantation ind i forkammeret i øjet ikke blot fordele transplantation terapier, udvider den til andre in vivo anvendelser for at studere fysiologiske og patofysiologiske processer, såsom signaltransduktion og cancer eller autoimmune sygdomme udvikling.
Introduction
Fremskridt i intravital mikroskopi har afsløret fysiologiske fænomener ikke forudsagt af in vitro-undersøgelser 1. Dette understreger udfordringen i at oversætte resultater opnået ved konventionel in vitro-metoder i den levende dyr. I det seneste årti var visualisering af væv i levende dyr væsentligt forbedret af de teknologiske fremskridt i billeddiagnostiske metoder 2, 3, 4, 5, 6. Dette har givet anledning et behov for in vivo imaging tilgange med mulig anvendelse i eksperimentelle dyremodeller for at muliggøre langsgående visualisering af målvæv ikke-invasivt.
Billeddannelsesteknikker, såsom magnetisk resonans og positronemissionstomografi eller bioluminescens har muliggjort ikke-invasiv billeddannelse af organer / væv dybt inde i legemet 7-8, 9. Men disse teknikker kan ikke opnå enkelt celle opløsning som følge af høje baggrundssignaler og lav rumlig opløsning, på trods af anvendelsen of høj kontrast materialer eller vævsspecifik luminescens 4. Dette blev behandlet med fremkomsten af to-foton fluorescens konfokal mikroskopi 10. To-foton mikroskopi aktiveret intravital billeddiagnostiske undersøgelser for at visualisere og kvantificere cellulære begivenheder med hidtil usete detaljer 11, 12. Dette har ført til karakteriseringen af de vigtigste biologiske processer i sundhed og sygdom 13, 14, 15, 16. Mens banebrydende intravital billeddiagnostiske undersøgelser primært har "efterlignet" in vivo forhold i udskårne væv (f.eks lymfeknuder), har andre undersøgelser brugt invasive metoder til billede udsatte målvæv in situ 17, 18, 19, 20, 21. Andre undersøgelser har også brugt "window kammer modeller" at omgå begrænsninger i forbindelse med invasive metoder og begrænset imaging opløsning in vivo 22, 23, 24, 25. I vinduet kammeret model, er et kammer med et transparent vindue kirurgisk implanteret ind i huden i forskelleje steder (ryg eller ørehud, bryst-fedtpuden, lever, osv.) af dyret (fx mus, rotte, kanin). Selv om denne fremgangsmåde tydeligt giver høj opløsning in vivo billeddannelse, kræver det en invasiv kirurgi at implantere afdeling og kan ikke være i stand til at rumme langsgående billeddiagnostiske undersøgelser over flere uger eller måneder 22.
Det blev for nylig vist, at en kombination af høj opløsning konfokal mikroskopi med en minimalt invasiv procedure, nemlig transplantation ind i det forreste kammer i øjet (ACE) tilvejebringer en "naturlig organ vindue" som en kraftfuld og alsidig in vivo-billeddannelse platform 26, 27. Transplantation ind i ACE er blevet anvendt i de sidste årtier til at studere biologiske aspekter af en række væv 28, 29, 30, og den seneste kombination med høj opløsning billeddannelse aktiveret undersøge fysiologien af pancreasøer med enkeltcelle-opløsning ikke- invasivt og i længderetningen <sup> 26, 27. Denne fremgangsmåde blev anvendt til at studere autoimmune responser under udviklingen af type 1 diabetes i dyremodeller (upublicerede data). Det blev også anvendt til at undersøge pancreasudviklingen, såvel som, i studier af nyrefunktionen ved at transplantere ind i ACE pancreas knopper eller individuelle nyrernes glomeruli, henholdsvis (upublicerede data). En nylig rapport ved hjælp af denne tilgang yderligere demonstreret sin ansøgning om at studere immunresponser efter pancreasø transplantation 31. Vigtigere er det, denne undersøgelse viste, at transplantation ind i det forreste kammer i øjet tilvejebringer en naturlig organ vindue til at udføre: (1) langsgående, ikke-invasiv billeddannelse af transplanterede væv in vivo, (2) in vivo cytolabeling at vurdere cellulær fænotype og levedygtigheden i situ, (3) realtidssporing af infiltrerende immunceller i målvævet, og (4) lokal indgriben ved topisk påføring eller intraokulær injektion.
Her vi demonstrate hvordan man udfører transplantation ind i det forreste kammer i øjet med Langerhanske øer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Murine pancreasøer blev isoleret ved hjælp af collagenasefordøjelse efterfulgt af oprensning på densitetsgradienter som beskrevet tidligere 33. Isolerede øer blev dyrket natten over før transplantation. Selv om dette ikke kræves, anbefales det at lade øerne at komme sig efter isoleringsproceduren. Dette er kritisk, når transplantation udføres i diabetiske recipienter, da det vil sikre transplantation for at overleve / robuste øer.
Transplantation er udført under genera…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender Drs. Camillo Ricordi, Antonello Pileggi, R. Damaris Molano, Stephan Speier og Daniel Nyqvist for frugtbare diskussioner. Vi takker også Eleut Hernandez og Diego Espinosa-Heidmann til teknisk bistand, og Mike Valdes og Margaret Formoso for at få hjælp med videooptagelse. Byron Maldonado optaget, redigeret og produceret den endelige video. Forskningsstøtte blev leveret af Diabetes Research Institute Foundation ( www.DiabetesResearch.org ), NIH / NIDDK / NIAID (F32DK083226 til MHA; NIH RO3DK075487 til AC; U01DK089538 til PO.B.). Yderligere forskning støtte til PO.B blev tilvejebragt gennem midler fra Karolinska Institutet, det svenske forskningsråd, det svenske Diabetes Foundation, Family Erling-Persson Foundation, Familie Knut og Alice Wallenberg Foundation, Skandia Insurance Company Ltd, levende ( FP7-228.933-2), strategisk forskningsprogram i Diabetes på Karolinska Institutet, Novo Nordisk Fonden, og Berth von Kantzow Fond.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Description/Comments |
| IsoTHESIA (Isoflurane) | Buttler Animal Health Supply | 11695-6775-2 | 99.9% Isoflurane/ml |
| Ketaset (Ketamine HCL) | Fort dodge Animal Health | 0856-2013-01 | Alternative injectable anesthesia |
| Beprenex (Buprenorphine HCL) | Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd. | 12496-075-7-1 | 0.3 mg/ml |
| Erythromycin Ophthalmic Ointment USP, 0.5% | Akron | 17478-070-35 | Applied prophylactically to transplanted eye |
| 0.9% Sodium Chloride (Saline) | Hospira Inc. | 0409-7983-03 | For iv injection. Sterile |
| PBS | Gibco | 10010-023 | 1X. Sterile |
| CMRL medium 1066 | Cellgro | 98-304-CV | Supplemented, CIT modification. Preferred media for islets |
References
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem. Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
- Leibiger, I. B., Caicedo, A., Berggren, P. O. Non-invasive in vivo imaging of pancreatic ?-cell function and survival – a perspective. Acta Physiol. (Oxf). , (2011).
- Wang, Y., Maslov, K., Kim, C., Hu, S., Wang, L. Integrated photoacoustic and fluorescence confocal microscopy. IEEE Trans Biomed. Eng. 57 (10), 2576-2578 (2010).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat. Methods. 7, 603-614 (2010).
- Aswathy, R. G., Yoshida, Y., Maekawa, T., Kumar, D. S. Near-infrared quantum dots for deep tissue imaging. Anal. Bioanal Chem. 397 (4), 1417-1435 (2010).
- Ghoroghchian, P. P., Therien, M. J., Hammer, D. A. In vivo fluorescence imaging: a personal perspective. Wiley Interdiscip Rev. Nanomed Nanobiotechnol. 1 (2), 156-167 (2009).
- Prescher, A., Mory, C., Martin, M., Fiedler, M., Uhlmann, D. Effect of FTY720 treatment on postischemic pancreatic microhemodynamics. Transplant Proc. 42 (10), 3984-3985 (2010).
- Leblond, F., Davis, S., Valdés, P., Pogue, B. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. J. Photochem. Photobiol. B. 98 (1), 77-94 (2010).
- Toso, C., Vallee, J. P., Morel, P., Ris, F., Demuylder-Mischler, S., Lepetit-Coiffe, M., et al. Clinical magnetic resonance imaging of pancreatic islet grafts after iron nanoparticle labeling. Am. J. Transplant. 8 (3), 701-706 (2008).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J. Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
- Denk, W., Delaney, K. R., Gelperin, A., Kleinfeld, D., Strowbridge, B. W., Tank, D. W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J. Neurosci. Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
- Khorshidi, M. A., Vanherberghen, B., Kowalewski, J. M., Garrod, K. R., Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H., et al. Analysis of transient migration behavior of natural killer cells imaged in situ and in vitro. Integr. Biol. (Camb). 3 (7), 770-778 (2011).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D., Parker, I. Immunoimaging: studying immune system dynamics using two-photon microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top99 (2011).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat. Med. , (2011).
- Fan, Z., Spencer, J., Lu, Y., Pitsillides, C., Singh, G., Kim, P., et al. In vivo tracking of ‘color-coded’ effector, natural and induced regulatory T cells in the allograft response. Nat. Med. 16 (6), 718-722 (2010).
- Sabek, O., Gaber, M. W., Wilson, C. M., Zawaski, J. A., Fraga, D. W., Gaber, O. Imaging of human islet vascularization using a dorsal window model. Transplant Proc. 42 (6), 2112-2114 (2010).
- Coppieters, K., Martinic, M. M., Kiosses, W. B., Amirian, N., von Herrath, M. A novel technique for the in vivo imaging of autoimmune diabetes development in the pancreas by two-photon microscopy. PLoS One. 5 (12), e15732 (2010).
- Martinic, M. M., von Herrath, M. G. Real-time imaging of the pancreas during development of diabetes. Immunol Rev. 221, 200-213 (2008).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window. J. Vis. Exp. (12), e678 (2008).
- Palmer, G. M., Fontanella, A. N., Shan, S., Hanna, G., Zhang, G., Fraser, C. L., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent. 6 (9), 1355-1366 (2011).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat. Rev. Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
- Taylor, M. The response of capillary endothelium to changes in intravascular pressure, as seen in the rabbit’s ear chamber. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 31 (5), 533-543 (1953).
- Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvasc. Res. 65 (2), 109-117 (2003).
- Speier, S., Nyqvist, D., Cabrera, O., Yu, J., Molano, R. D., Pileggi, A., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat. Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Speier, S., Nyqvist, D., Kohler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nat. Protoc. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Falck, B. Site of production of oestrogen in the ovary of the rat. Nature. 184, 1082 (1959).
- Bickford-Wimer, P., Granholm, A. C., Bygdeman, M., Hoffer, B., Olson, L., Seiger, A., et al. Human fetal cerebellar and cortical tissue transplanted to the anterior eye chamber of athymic rats: electrophysiological and structural studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (16), 5957-5961 (1987).
- Adeghate, E., Donath, T. Morphological findings in long-term pancreatic tissue transplants in the anterior eye chamber of rats. Pancreas. 5 (3), 298-305 (1990).
- Abdulreda, M. H., Faleo, G., Molano, R. D., Lopez-Cabezas, M., Molina, J., Tan, Y., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).
- Unutmaz, D., Xiang, W., Sunshine, M. J., Campbell, J., Butcher, E., Littman, D. R. The primate lentiviral receptor Bonzo/STRL33 is coordinately regulated with CCR5 and its expression pattern is conserved between human and mouse. J. Immunol. 165 (6), 3284-3292 (2000).
- Pileggi, A., Molano, R. D., Berney, T., Cattan, P., Vizzardelli, C., Oliver, R., et al. Heme oxygenase-1 induction in islet cells results in protection from apoptosis and improved in vivo function after transplantation. Diabetes. 50 (9), 1983-1991 (2001).
