電気生理学および高分解能二光子顕微鏡用マウス前庭感覚上皮の切り抜き半無傷準備

サマリー

前庭有毛細胞機能の解析は頭蓋骨の最も困難な部分の奥深くの位置、側頭骨錐体によって複雑になる。最も機能有毛細胞研究は、急性単離された有毛細胞を使用している。ここでは、電気生理学的および二光子顕微鏡研究のためのマウス前庭上皮の半無傷の準備について説明します。

要約

理解前庭有毛細胞は、正常な条件の下で機能する、またはどのように外傷、疾患、およびこの機能を混乱させる老化、予防的アプローチ、および/または新たな治療戦略の開発に重要なステップです。しかし、異常な前庭機能を見て研究の大半は、細胞レベルではなかったが、このような歩行分析と前庭動眼反射性能として前庭機能障害の行動アッセイに主に焦点を当てた。この作品は物事がうまくいかないときに何が起こるかについての貴重なデータが得られているが、少し情報が障害の根本的な原因に関して収集されます。前庭機能の基礎となる細胞および細胞内のプロセスに焦点を当てている研究のうち、ほとんどは彼らのシナプス接続と支持細胞環境を欠い急性単離し有毛細胞、に頼ってきた。したがって、主要な技術的課題は、準備中で絶妙に敏感前庭有毛細胞にアクセスしている少なくとも生理的に、中断されaration。ここでは、有毛細胞/一次求心錯体を含む地元の微小環境を保持マウス前庭感覚上皮の半無傷の準備を示しています。

概要

私たちの日常生活への前庭系の重要な貢献にもかかわらず、加齢に伴う前庭機能の観察された減少の責任のプロセスを明確に理解することは、とらえどころのないまま。知識の欠如のための一つの理由は、その前庭機能の低下がほぼ独占的に前庭動眼反射（VOR）、外因性前庭機能の正確な指標を含む行動のアッセイを使用して検討されているですが、本質的な構成要素の変更に限定された洞察力を提供しています。これは、健康、病気、あるいは老化に前庭有毛細胞機能の理解への大きな障害である。

個々の前庭有毛細胞の多くの研究が行われてきたが、主要な欠点​​は、有毛細胞、さらには萼求心端子は、機械的および/または酵素的処理により、通常の環境から除去される急性有毛細胞調製物、に依存している。このようなアプローチinevitaブライ有毛細胞や萼、及び有毛細胞と支持細胞との間の微妙なマイクロアーキテクチャを混乱させる。半無傷の準備^1-5、及び孤立マウス迷路の準備⁶の発展に伴い、より密接に、生体内でそれらの似ている条件の下でシナプスのコミュニケーションの様々な形態を勉強する機会が用意されました。実際、林ら （2011）I前庭有毛細胞は神経上皮内に埋め込 ​​まれて残ったものに比べて急性孤立型から記録された全細胞電流の著しい差が認められた。具体的には、カリウム有毛細胞と求心萼間の間隙内に蓄積すると考えられ、著しく有毛細胞応答^7を変....

プロトコル

1。動物

1. マウスは、オーストラリアの齧歯類センター（ARC、パース、オーストラリア）から入手し、環境エンリッチメントとノーマルの12時間の明/暗サイクルでシドニーボッシュ動物施設の大学で開催された。記載されたすべての実験は、シドニーの動物倫理委員会の大学によって承認された。
2. この菌株は一般に遺伝子操作の背景として使用され、 野生型 ^8-9と同等とみなすことができるので、雄と雌のマウス（C57/BL6）は、すべての実験に使用した。

2。組織標本

1. 26のNaHCO _3、11グルコース、250グリセロール、2.5のKCl、1.2のNaH ₂ PO _4、1.2のMgCl _2、及び2.5のCaCl ₂から成るグリセロールベースの人工脳脊髄液（ACSF）（単位：mm）300mlのを準備します。 CaCl _2を添加する前に、ガスカーボゲン（95％O ₂および5％CO _2）を含む溶液は、APを確立する7.4のHとカルシウム沈殿（曇り）を回避。氷スラリーが形成されるように、45分間-80℃の冷凍庫内の溶液を凍結。
2. 深く腹腔内注射を介して、ケタミン（100 mg / kg）を（パーネル、アレクサ....

結果

前庭有毛細胞の電気生理学的特性は、それらが⁰⁷埋め込 ​​まれている内に複雑なマイクロアーキテクチャに依存している。 図半無傷の前庭上皮製剤は、タイプI有毛細胞（ 図5A）、タイプIIの有毛細胞を区別するために使用することができることを図5 （ 図5B）、そして特徴的な全細胞コンダクタンスに基づい萼一次求心（ 図5C）。これらの特性は、脱分極とI型有毛細胞、および（ 図5Cの矢印）萼一次求心で活動電位を表す過渡内向きナトリウム電流の存在下で大規模な"崩壊"のテール電流の間に顕著な"たるみ"が含まれています。

製剤は、個々の前庭有毛細胞型に老化の影響を定量化するために使用することができる。 図6は、コンダクタンス（Fを比較若者と高齢マウスで負静止電位からの.......

ディスカッション

バランス感覚のメカニズムは、視覚と聴覚のシステムを、たとえば 、他の感覚系と比較して限定され注目を集めている。前庭やバランス機能の変化を調べた研究のうち、ほとんどはバランス前庭有毛細胞自体の基本的なビルディングブロックの不完全な知識で、前庭動眼反射を含む行動の対策に焦点を当てている。彼らのネイティブ環境から削除急性孤立有毛細胞を用いたので、有毛細胞に集中しているこれらの研究は、ほとんど常に行っている。この記事では、これらの基礎研究を発展させ、マウス前庭感覚上皮の半無傷の準備を示しています。

前庭有毛細胞は比較的堅牢ですが、半無傷準備のユーティリティは切除の速度に決定的に依存しています。一般的に、準備はカンガルーで実行可能なままになります切除後約2-5時間の期間のためのM温度。したがって、動物が記録に安楽死されたときからの時間を最小限に抑えることが重要です。切除は、3週齢のマウス（5-7分合計）のために、比較的簡単かつ迅速であるが、高齢動物（最大9ヶ月齢のマウスでは25分まで）に徐々に、より困難になることができます。これらの古い動物では、解剖の温度が重要な決定要因で.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
REAGENTS
Leibovitz medium L-15	Sigma Aldrich	L4386-10X1L
BAPTA-1-oregon green	Invitrogen	O6806
EQUIPMENT
Stereo microscope	Leica Microsystems	A60S
Upright microscope	Olympus	BX51WI
二光子顕微鏡	オリンパス/ラビジョン	BX51WI/ TriMScope II
デュモン #5 SF鉗子	FST	11252-00
フリードマン・ピアソン ロンガース	FST	16221-14
スタンダードパターンハサミ	FST	14001-12
インストラテック A-Dコンバーター	HEKA	ITC-18
サッターマイクロマニピュレーター		Sutter MP-225/M
マルチクランプアンプ	Axon Instruments	700B
データ収集ソフトウェア(電気生理学)	Axograph	N/A
Imspector データ収集ソフトウェア(2光子)	Max Planck innovation	N/A