Un metodo semplice è descritto per l'induzione della transizione epitelio mesenchimale (EMT) in una varietà di tipi cellulari. Metodi per l'analisi di cellule in EMT stati di immunocitochimica sono inclusi.
La transizione epitelio mesenchimale (EMT) è essenziale per il corretto morfogenesi durante lo sviluppo. Una cattiva regolazione di questo processo è stato implicato come un evento chiave nella fibrosi e la progressione dei carcinomi a uno stato metastatico. Comprendere i processi che sono alla base EMT è indispensabile per la diagnosi precoce e il controllo clinico di questi stati patologici. Induzione affidabile di EMT in vitro è un utile strumento per la scoperta di farmaci e di identificare firme comuni espressione genica per scopi diagnostici. Qui mostriamo un metodo semplice per l'induzione di EMT in una varietà di tipi cellulari. Sono inclusi anche i metodi per l'analisi di cellule pre-e post-induzione EMT immunocitochimica. Inoltre, abbiamo dimostrato l'efficacia di questo metodo attraverso l'analisi di matrice a base di anticorpi e saggi di migrazione / invasione.
La transizione epitelio mesenchimale (EMT) è il processo mediante il quale una cellula epiteliale polarizzata subisce vari cambiamenti risultanti in una cella mesenchimali fibroblasto-come altamente mobili. Questo processo avviene, in parte, attraverso cambiamenti di espressione genica e della degradazione delle giunzioni adherens, con un conseguente aumento della capacità di migrare e invadere. Fisiologicamente, EMT svolge un ruolo importante durante lo sviluppo embrionale e la guarigione delle ferite. Perdita di controllo adeguato su EMT può portare a fibrosi e metastasi dei carcinomi 1,2.
La riduzione di E-caderina sulla superficie delle cellule epiteliali è una fase critica nella progressione di una cellula attraverso EMT 3,4. E-caderina è una proteina transmembrana a passaggio singolo che interagisce direttamente con le proteine caderina sulle cellule adiacenti. Oltre al suo ruolo nella adesione cellulare, segnalazione E-caderina influenze cellulare tramite interazioni tra la coda citoplasmatica di E-caderina unda varietà di proteine regolatrici, in particolare β-catenina. β-catenina gioca un ruolo nella stabilizzazione adherens giunzioni. Durante segnalazione canonica Wnt, β-catenina viene rilasciato da E-caderina e traslocato nel nucleo dove agisce come un fattore di trascrizione a valle nel pathway Wnt 3,4,5. Nel nucleo, β-catenina ha dimostrato di aumentare la trascrizione di numerosi fattori EMT-relativi compreso Twist, Slug, fibronectina, e una varietà di metalloproteasi della matrice 3,6.
Oltre a Wnts, segnalazione del TGF-β ha dimostrato di giocare un ruolo significativo nella induzione EMT sia durante lo sviluppo normale e in stati malati 7,8,9. TGF-β è coinvolto nella EMT che si verifica durante la formazione palato e nel cuore di sviluppo 10. E 'stato anche implicato nella fibrosi e nella progressione del cancro alla metastasi 7.
La procedura qui descritta provides induzione di EMT consistente in una varietà di tipi di cellule senza la necessità di manipolazione genetica. Questa procedura utilizza un cocktail di E-caderina, sFRP-1, e Dkk-1 bloccanti anticorpi e Wnt-5a e proteine ricombinanti TGF-β1. Questo cocktail è stato progettato per bloccare E-caderina base di aderenza, migliorando Wnt e TGF-β. La possibilità per l'induzione EMT robusto è fondamentale per la comprensione della biologia di questo processo e come manipolare per scopi terapeutici. Indicatori comuni correnti di EMT, E-caderina (inibiti in EMT) e Vimentin (sovraregolata in EMT), si possono trovare co-espressi nei tumori e quindi non forniscono le migliori marcatori diagnostici di potenziali cellule metastatiche 12. È importante sottolineare che l'analisi di una varietà di tipi di cellule che hanno subito EMT è utile sviluppare firme espressione genica comuni che possono essere utilizzati per scopi diagnostici in cancro e fibrosi 11. Inoltre, recenti studi hanno dimostrato che EMT può giocare un ruolo nella formazione di cellule staminali tumorali, suggerendo che le cellule che hanno subito EMT possono essere utili per lo screening di farmaci per identificare composti che possono indirizzare queste cellule 13.
I metodi precedenti per l'induzione EMT sono generalmente utilizzati TGF-β stimolazione o modificazione genetica. Sebbene TGF-β da solo ha mostrato di indurre EMT in alcuni tipi di cellule, è stato ora dimostrato che TGF-β è necessaria per EMT, ma non è sufficiente in tutti i tipi di cellule 6,14. Utilizzo di modificazione genetica per l'induzione EMT è in termini di tempo e manodopera. Il metodo qui descritto utilizza una combinazione di fattori, tra cui, E-caderina anti-umano, sFRP-1 anti-umano, Dkk-1 anti-umano, ricombinante umano Wnt-5a e ricombinante TGF-β1 umano per indurre affidabile EMT. Questa combinazione di fattori è progettata per bloccare E-base-caderina adesione, un passaggio critico per l'induzione EMT 4, e migliorare Wnt aggiungendo la proteina Wnt-5a nonché utilizzando anticorpi bloccanti agli inibitori di Wnt, sFRP-1 e Dkk -1. Wnt e TGF-β hanno dimostrato di agire in un loop autocrino per indurre e mantenere la stat cellule mesenchimalie 6. Questo metodo di induzione evita la manipolazione genetica ed è più efficace rispetto all'utilizzo di TGF-β alone. Importante, siamo in grado di osservare l'induzione di EMT in tipi cellulari, comprese MCF7 e PANC-1 le cellule, che sono stati precedentemente mostrato di non rispondere esclusivamente alla stimolazione TGF-β (figura 5) 14.
Le cellule trattate con supplemento spettacolo EMT Indurre media morfologia fusiforme meno compatto e aumentata (Figura 1). Inoltre, vi è una riduzione della superficie E-caderina espressione concomitante con un aumento della fibronectina, che sono caratteristiche di EMT (figure 2 e 3). Altri marcatori mesenchimali quali Vimentin e la lumaca sono anche sovraregolati nelle EMT cellule indotte, rispetto ai controlli non indotte (Figura 4). Aumento capacità di migrazione e di invasione sono le principali caratteristiche funzionali delle cellule mesenchimali. In in vitro </em> Migrazione e l'invasione saggi, cellule trattate con supplemento EMT Induzione supporti dimostrato un significativo aumento di capacità di migrare e invadere (Figura 6).
Questo semplice metodo per l'induzione EMT è utile per lo studio di segnalazione EMT come dimostrato utilizzando i dati di espressione di matrice anticorpo mostrati nella Figura 7. Diversi tipi di cellule possono essere confrontati pre-e post-induzione EMT avere profili di espressione comuni associati con EMT, come l'aumento della CREB fosforilato e ERK1 / 2 risulta sia MCF7 e cellule EMT indotta A549. S133 fosforilazione di CREB stimola legame al DNA ed è stato dimostrato di agire a valle di TGF-β1-indotta EMT 15. ERK1 / 2 fosforilazione è stato anche dimostrato di agire a valle di TGF-β1-indotta EMT 16. Le differenze a vie di segnalazione tra tipi cellule possono anche essere chiariti come visto con l'aumento della GSK-3β fosforilazione in cellule A549 rispetto p70S6K fosforilazione in MCF7. GSK-3β fosforilazione della serina 9 diminuisce funzione, e GSK-3β ha dimostrato di inibire il fattore di trascrizione pro-EMT, lumaca 17. Al contrario, p70S6K induce l'attività della lumaca e la sua fosforilazione è associata con l'attivazione di questa proteina 18.
Nel complesso, l'induzione semplice e affidabile di EMT, in particolare nelle cellule precedentemente indicate non rispondere unicamente a TGF-β, è utile per comprendere la biologia di EMT, identificando firme espressione comune per l'uso come marcatori prognostici, e sviluppare e valutare nuove terapie per il cancro e la malattia fibrotica.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare Julia Hatler e Martin Ramsden (R & D Systems) per l'utile discussione e revisione del manoscritto.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Epithelial cells of interest | We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1 | ||
EMT Inducing Media Supplement | R & D Systems | CCM017 | |
Recombinant Human TGF-β1 | R & D Systems | 240-B | Used at 10ng/ml |
Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody | R & D Systems | NL648R | Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry |
Anti-E-Cadherin | R & D Systems | MAB1838 | Used at 0.1 μg/ml for western blotting |
Anti-Fibronectin | R & D Systems | MAB1918 | Used at 10 μg/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 μg/ml for western blotting |
Anti-GAPDH | R & D Systems | AF5718 | Used at 0.2 μg/ml for western blotting |
Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody | R & D Systems | NL009 | Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry |
Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody | R & D Systems | HAF109 | Used at 1:2000 for western blotting |
Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody | R & D Systems | HAF007 | Used at 1:2000 for western blotting |
EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit | R & D Systems | SC026 | Used according to the manufacturer’s instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail. |
96 Well BME Cell Invasion Assay | R & D Systems | 3455-096-K | This kit was used according to the manufacturer’s recommendations. |
Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit | R & D Systems | ARY002B | This kit was used according to the manufacturer’s recommendations19. |
Mounting Media | R & D Systems | CTS011 | |
0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15350-061 | |
1X Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
95% Ethanol | |||
Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | |
Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
Triton-X-100 | Roche Molecular Biochemicals | 789-704 | Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration. |
DAPI Solution | Sigma | D9542 | Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS. |
Fine pointed curved forceps | Thermo-Fisher Scientific | 08-875 | |
12 mm coverslips | Carolina Biological | 633009 | |
Nonfat dry milk | Used at 5% in TBST for blocking in western blotting | ||
TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20] | For western blotting blocking and washing | ||
PVDF Membrane | For western blotting | ||
4-20% SDS-page gel | For western blotting | ||
ECL substrate | For western blotting | ||
15 ml conical tubes | |||
Plates/flasks, tissue culture treated | |||
24-well plates, tissue culture treated | |||
Pipettes / pipette tips | |||
Pipet Aid / pipets | |||
Hemocytometer | |||
37 °C Water Bath | |||
37 °C/5%CO2 Incubator | |||
Centrifuge | |||
Inverted light microscope | |||
Fluorescence microscope |