海马体小鼠脑片的改良制备与保存方法以实现长期增强作用的非常稳定且可重复的记录

摘要

本文介绍了一种完整的方法，用于制备和保存 体外 成年小鼠急性海马脑片。该方案可实现超过8小时的稳定持久长时程增强（LTP）记录，成功率高达95%。

摘要

长时程增强（LTP）是一种突触可塑性，其特征是突触强度增加，被认为参与了记忆的编码过程。在急性海马脑片CA1区诱导的LTP已被广泛研究。然而，这一现象维持阶段的分子机制仍不清楚。这在一定程度上可能归因于不同实验室所采用的各种实验条件。事实上，LTP的维持阶段高度依赖于氧气供应、温度和湿度等外部参数，同时也受切片平面方向以及解剖后脑片活性等内部参数的影响。

优化所有这些参数能够诱导出高度可重复且非常稳定的长期增强效应。该方法为深入探究海马脑片中突触强度稳定增强所涉及的分子机制提供了可能，同时也强调了实验条件的重要性。 体外 神经生理学现象的研究

引言

如今，人们对复杂记忆在神经环路水平上如何存储和提取的理解仍然有限。然而，关于记忆存储存在一个统一且被广泛接受的假说：记忆以中枢神经系统中神经元之间突触连接强度的改变形式进行存储。突触可塑性的研究在很大程度上得益于两项突破性发现。（1）在一项具有里程碑意义的实验中，Bliss 和 Lomo ¹，利用麻醉的完整兔发现，对海马的穿通纤维通路施加短暂的高频刺激（1秒，100赫兹），可导致相关突触连接出现持久性（数小时）增强。这一引人注目的现象于1975年由Douglas和Goddard命名为“长时程增强”（Long-Term Potentiation，LTP） ²（2）随后发现，在人工维持存活的脑切片（0.4 mm）中也可诱发类似现象 体外最广泛研究的LTP被观察到 体外 通过向一束轴突（即所谓的Schaffer侧支）施加一次或多次强直刺激，同时记录在所谓的CA1区锥体神经元中诱发的场兴奋性突触电位。LTP诱导的机制已基本阐明。本质上，Ca²⁺ NMDA受体介导的离子内流会激活酶，产生两个结果：AMPA受体的磷酸化（增强其功能效率）以及额外AMPA受体插入突触后膜 ³相比之下，LTP维持阶段的机制在很大程度上仍不清楚，尤其是因为从实验操作上而言，将脑片在健康状态下维持数小时远比维持30至60分钟困难得多。

大量研究致力于揭示长时程增强（LTP）的机制，多年来已....

方案

所有动物实验均依照美国国立卫生研究院关于实验动物护理与使用的法规以及当地伦理委员会的同意进行。

1. 人工脑脊液的制备

在静息期和电生理记录期间，使用相同的灌流液进行脑片的分离、切割和灌注（1 ml/min）。该灌流液的成分为 124 mM NaCl、4.4 mM KCl、26 mM NaHCO₃、1 mM NaH₂PO₄、2.5 mM CaCl₂、1.3 mM MgSO₄ 和 10 mM D-葡萄糖。

1. 称取配制 2 L ACSF 所需的各组分，但 MgSO₄ 除外（因其已配制成 1 M 溶液）。使用标准溶液可确保 Mg²⁺ 浓度准确，因为粉末状 MgSO₄ 具有强吸湿性。Ca²⁺ 与 Mg²⁺ 的比例对长时程增强（LTP）的诱导和维持具有显著影响¹⁴，因此必须严格保持其比例。
2. 将除 CaCl₂ 外的所有组分加入一个玻璃量筒中，并用蒸馏 H₂O 定容至 2 L。
3. 剧烈搅拌。待所有成分完全溶解后，通过连接在容器上的鱼缸曝气头和管路通入碳氧混合气体（95% O₂

结果

该方法已被用于分析从成年C57Bl/6J小鼠（JANVIER SAS，法国）急性海马脑片中诱导的持久性长时程增强（LTP）的特性¹⁴。令人意外的是，实验条件的优化促使我们以一种全新的视角来观察LTP。我们发现，突触强度的持久性增强并不依赖新蛋白质的合成。

此处，我们证明长时程增强（LTP）的诱导依赖于脑片的存活率和兴奋性。当海马体解剖过程过慢或造成过多损伤时，脑片的兴奋性会升高，在LTP诱导后可观察到多突触反应（图3B）。在此情况下，LTP的诱导效果显著降低，且增强效应无法维持。

需要强调的是，即使在看似健康的脑片中，技术条件对单次刺激串诱导的长时程增强（LTP）持续时间也有很大影响。在先前的发表文章中，我们的研究组已证明，通过改变脑片的恢复条件，可将短暂的LTP转变为持久的LTP¹⁵。在多年的日常实验实践中，我们观察到，随着技术的逐步改进，在标准条件下单次刺激串诱导的LTP持续时间也逐步延长。事实上，2005年记录的实验结果显示，LTP仅短暂维持，.......

讨论

我们在本实验室开发了一种实验方案，该方案结合了其他具有丰富LTP记录经验的实验室所建立和使用的方法^11,17。此方案适用于成年小鼠海马组织，可用于任何年龄和任何遗传背景品系的小鼠。同时，该方案也可用于分析在阿尔茨海默病等神经退行性疾病模型的转基因小鼠中LTP的变化^18,19。

在大鼠海马脑片中应用本方案可能需要进行一些调整。例如，大多数在大鼠中开展的研究采用32 °C而非28 °C的温度。Mathis et al. ²⁰ 提出了一种用于制备老龄小鼠或大鼠海马脑片的替代方法。

材料与方法

C57BL/6J 小鼠来自法国 JANVIER SAS，但使用法国 Charles River 提供的 C57BL/6J 小鼠也可获得相同结果。

将组织浸没在冰冷的ACSF中快速分离海马，以减少细胞损伤。这种方法能够降低兴奋性毒性，但已知会诱导突触增.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂/材料
NaCl	Sigma - Aldrich	S7653
NaHCO3	Sigma - Aldrich	S8875
KCl	Sigma - Aldrich	P9333
D-葡萄糖	Sigma - Aldrich	G7528
NaH2PO4	Sigma - Aldrich	S9638
MgSO4 1M	Sigma - Aldrich	63126
CaCl2	Sigma - Aldrich	C4901
碳合气	Air Liquide (比利时)
毛细管	WPI, Inc. (英国)	TW150-4
刺激电极	FHC (美国)	CE2B30
手术器械	FST (德国)
滤纸 84 g/m2	Sartorius	FT-3-105-110
网状材料	Lycra	15 旦
胶水	UHU	plus endfest300
仪器
放大器	WPI, Inc. (英国)	ISO-80
界面记录室	FST (德国)
蠕动泵	Gilson (美国)	Minipuls 3
温度控制器	爱丁堡大学	www.etcsystem.com
组织切片机	Mcllwain
刺激器	Grass (美国)	S88X + SIU-V
数据分析程序	WinLTP	www.winltp.com
显微操作器	Narishige	MM-3 和 MMO-220A
手术显微镜	Leica Microsystem
A/D 转换器	National Instruments	NIPCI-6229 M系列