रोगाणु की तरह कोशिकाओं में नवजात माउस त्वचा प्राप्त स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव<em> इन विट्रो में</em
Summary
हाल के वर्षों में इन विट्रो संस्कृति तरीकों में उपयोग कर जर्म कोशिकाओं के गठन दैहिक स्टेम कोशिकाओं के कई अलग अलग प्रकार का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया गया है. यह लेख नेत्रहीन जल्दी डिम्बाणुजनकोशिका कोशिकाओं की तरह करने के लिए नवजात माउस ली गई स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव को पेश करेंगे.
Abstract
रोगाणु सेल गठन और भेदभाव का अध्ययन कर पारंपरिक रूप से कम सेल नंबर और विकासशील भ्रूण के भीतर गहरे अपने स्थान के कारण बहुत मुश्किल हो गया है. इन विट्रो आधारित प्रणाली में एक "बंद" की उपलब्धता gametogenesis के बारे में हमारी समझ के लिए अमूल्य साबित हो सकता है. नवजात माउस त्वचा से अलग दैहिक स्टेम सेल से oocyte की तरह कोशिकाओं (OLCs) के गठन को प्रदर्शित किया गया है और इस वीडियो प्रोटोकॉल में देखे जा सकते हैं. परिणामस्वरूप OLCs ऐसे Oct4, वासा, Bmp15, और Scp3 रूप oocytes के साथ लगातार विभिन्न मार्करों व्यक्त करते हैं. हालांकि, वे परिपक्वता या अर्धसूत्रीविभाजन पूरा करने के लिए एक विफलता के कारण निषेचन से गुजरना करने में असमर्थ रहते हैं. इस प्रोटोकॉल अधिक परिपक्व युग्मकों में जर्म कोशिकाओं के प्रारंभिक चरण के गठन और भेदभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है कि एक प्रणाली प्रदान करेगा. जल्दी भेदभाव के दौरान Oct4 व्यक्त कोशिकाओं की संख्या (संभावित रोगाणु कोशिकाओं की तरह) लेकिन वर्तमान में, च ~ 5% तक पहुँचOLCs की ormation के अपेक्षाकृत अक्षम रहता है. विशेष देखभाल शुरू सेल आबादी स्वस्थ और एक जल्दी पारित होने में है सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए हालांकि प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सीधे आगे है.
Introduction
जल्दी embryogenesis दौरान gametogenesis मौलिक रोगाणु सेल (PGC) गठन, प्रवास, और जननांगों लकीरें के अंत में बसाना सहित चरणों की एक श्रृंखला के माध्यम से होता है. इस समय के दौरान PGCs तेजी से और अधिक परिपक्व युग्मक 1 में प्रसार और भेदभाव से गुजरना. PGCs भ्रूण पश्चांत्र में अपरापोषिका के आधार से और अंत में अंत में जननांगों लकीरें बस्तियां पृष्ठीय दीवार के साथ विस्थापित तथ्य यह है कि 2 अध्ययन करने के लिए उन्हें बेहद मुश्किल बना देता है. क्षेत्र में प्रगति के बावजूद, PGC गठन और भेदभाव को समझने का प्रयास पढ़ाई अपने सीमित संख्या, स्थान, और प्रवासी प्रकृति 3,4 द्वारा बाधित किया गया है.
हाल के वर्षों में भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं इन विट्रो 5,6 में रोगाणु कोशिकाओं के रूप में करने की क्षमता है करने के लिए दिखाया गया है. इसी तरह, कई दैहिक स्टेम कोशिकाओं को भी रोगाणु कोशिकाओं foll फार्म की क्षमता है करने के लिए दिखाया गया हैइन विट्रो संवर्धन 7-11 में कारण. हाल ही में नवजात माउस त्वचा से अलग स्टेम सेल रोगाणु कोशिकाओं की तरह है और प्रारंभिक चरण oocytes 12 में इन विट्रो में भेदभाव कर रहे थे. भेदभाव के दौरान Oct4 व्यक्त स्टेम कोशिकाओं के सबसेट वृद्धि हुई है और संरचनाओं जैसी मेघपुंज-oocyte के परिसरों का गठन किया गया. डिम्बाणुजनकोशिका की तरह कोशिकाओं (OLCs) संस्कृतियों से उठाया और प्राकृतिक oocytes की तुलना में किया जा सकता है. 40-45 माइक्रोन मापने इस संस्कृति विधि OLCs का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं कि इस तरह के Gdf9b, वासा, और DAZL रूप oocytes को व्यक्त करने के लिए इसी तरह की मार्करों. तिथि करने के लिए जिसके परिणामस्वरूप OLCs 12 परिपक्व करने के लिए या निषेचित करने में असमर्थ रहते हैं.
OLCs इन OLCs फार्म का उपयोग किया प्रोटोकॉल अभी भी भीतर पहले चरण रोगाणु कोशिकाओं के निर्माण और विकास का अध्ययन करने के लिए एक परख के रूप में उपयोगिता हो सकती है कार्य करने में असमर्थ रहते हैं एक इन विट्रो प्रणाली में बंद कर दिया. इतने से OLCs के गठन पर चर्चा के मूल प्रकाशनराजनयिक स्टेम कोशिकाओं को एक स्टेम सेल के स्रोत के रूप में 8 भ्रूण सुअर त्वचा का उपयोग किया. प्रेरित भेदभाव के दौरान जल्दी गठन PGC कोशिकाओं की तरह, Oct4 रूप OLCs और एक्सप्रेस ऐसे PGC मार्कर को वासा, स्टेला, सी किट, और DAZL 13 व्यापारियों होना दिखाया गया है कि अध्ययन पर विस्तार. इस डेटा में इन विट्रो में जर्म सेल गठन और भेदभाव का अध्ययन करने के लिए इस प्रणाली का उपयोग करने की क्षमता का समर्थन करता है. नवजात माउस त्वचा से OLCs उपयोग के लिए फार्म प्रोटोकॉल इस वीडियो लेख में प्रदर्शन किया जाएगा. इस प्रोटोकॉल उनके प्रसार और भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण कारक है स्पष्ट करने के लिए एक साधन उपलब्ध करा सकता है कि रोगाणु सेल विकास का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में एक प्रदान करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
कार्यात्मक OLCs तिथि करने के लिए इन विट्रो परख में एक पूरी तरह से विकसित का उपयोग नहीं किया गया है. हाल हयाशी एट अल द्वारा एक अध्ययन. इन विट्रो में गठन किया है और आगे के विकास के लिए 14 vivo में…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
पीडब्ल्यूडी पश्चिमी विश्वविद्यालय में गेराल्ड एम. किडर को स्वास्थ्य अनुसंधान फैलोशिप (CIHR) और एक CIHR अनुदान की कनाडा के संस्थानों द्वारा समर्थित है. लेखक भी यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल के विकास के साथ मदद के लिए Guelph विश्वविद्यालय में Julang ली स्वीकार करना चाहते हैं.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24 well plates | Nunc | 144530 | |
| 10 cm dishes | VWR | 25384-088 | |
| 15 ml tubes | BD | 352095 |
References
- van den Hurk, R., Zhao, J. Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles. Theriogenology. 63, 1717-1751 (2005).
- Molyneaux, K. A., Stallock, J., Schaible, K., Wylie, C. Time-lapse analysis of living mouse germ cell migration. Dev. Biol. 240, 488-498 (2001).
- Lawson, K. A., Hage, W. J. Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse. Ciba Found Symp. 182, 68-91 (1994).
- Ginsburg, M., Snow, M. H., McLaren, A. Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation. Development. 110, 521-528 (1990).
- Hubner, K., Fuhrmann, G., et al. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. Science. 300, 1251-1256 (2003).
- Toyooka, Y., Tsunekawa, N., Akasu, R., Noce, T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11457-11462 (2003).
- Wang, L., Cao, J., et al. Oocyte-like Cells Induced from Mouse Spermatogonial Stem Cells. Cell Biosci. 2, 27 (2012).
- Dyce, P. W., Wen, L., Li, J. In vitro germline potential of stem cells derived from fetal porcine skin. Nat. Cell Biol. 8, 384-390 (2006).
- Danner, S., Kajahn, J., Geismann, C., Klink, E., Kruse, C. Derivation of oocyte-like cells from a clonal pancreatic stem cell line. Mol. Hum. Reprod. 13, 11-20 (2007).
- Cheng, X., Chen, S., Yu, X., Zheng, P., Wang, H. BMP15 gene is activated during human amniotic fluid stem cell differentiation into oocyte-like cells. DNA Cell Biol. 31, 1198-1204 (2012).
- Song, S. H., Kumar, B. M., et al. Characterization of porcine multipotent stem/stromal cells derived from skin, adipose, and ovarian tissues and their differentiation in vitro into putative oocyte-like cells. Stem Cells Dev. 20, 1359-1370 (2011).
- Dyce, P. W., Liu, J., et al. In vitro and in vivo germ line potential of stem cells derived from newborn mouse skin. PLoS One. 6, e20339 (2011).
- Linher, K., Dyce, P., Li, J. Primordial germ cell-like cells differentiated in vitro from skin-derived stem cells. PLoS One. 4, e8263 (2009).
- Hayashi, K., Ogushi, S., et al. Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell-Like Cells in Mice. Science. , (2012).
