Differentiering av nyfödda mus härledda hudens stamceller i Germ-liknande celler<em> In vitro</em

Summary

På senare år bildandet av könsceller användning av in vitro odlingsmetoder har visats med användning av flera olika typer av somatiska stamceller. Denna artikel kommer att visuellt presentera differentiering av nyfödda härledda musstamceller till tidiga äggcellen-liknande celler.

Abstract

Studera formation könsceller och differentiering har traditionellt varit mycket svårt på grund av låga cellantal och deras placering djupt i utvecklingsländerna embryon. Tillgången till ett "stängt" in vitro-baserat system kan visa sig ovärderligt för vår förståelse av gametogenes. Bildandet av äggceller-liknande celler (OLCs) från somatiska stamceller isolerade från nyfödd mus hud, har påvisats och kan visualiseras i denna video protokoll. De resulterande OLCs uttrycker olika markörer som överensstämmer med oocyter som Oct4, Vasa, Bmp15 och Scp3. Däremot förblir de oförmögna att genomgå mognad eller befruktning på grund av ett misslyckande att slutföra meios. Detta protokoll kommer att tillhandahålla ett system som är användbart för att studera det tidiga stadiet bildning och differentiering av könsceller mot mognare gameter. Under tidig differentiering av antalet celler som uttrycker Oct4 (potentiella grodden-liknande celler) når ~ 5%, dock för närvarande fFörnyelsen av OLCs förblir relativt ineffektiv. Protokollet är relativt enkelt men särskild försiktighet bör vidtas för att säkerställa startcellen befolkningen är frisk och på ett tidigt passage.

Introduction

Under tidig fosterutveckling sker gametogenes genom en serie steg, inklusive ursprungliga könsceller (PGC) bildande, migration, och slutligen kolonisering av gonadala åsar. Under denna tid PGCs genomgår proliferation och differentiering till alltmer mer mogna könsceller ^1. Det faktum att PGCs migrera från basen av allantois i embryot hindgut och slutligen längs ryggens väggen slutligen kolonisera de gonadala åsar gör dem ytterst svåra att studera ^2. Trots framsteg inom området, har studier som försöker förstå PGC bildning och differentiering har hindrats av deras begränsade antal, placering, och flyttande art ^3,4.

Under senare år har embryonala stamceller har visat sig ha potential att bilda könsceller in vitro ^5,6. På samma sätt har flera somatiska stamceller också visat sig ha potential att bilda könsceller follgrund odling in vitro ^7-11. Nyligen stamceller isolerade från nyfödd mus hud differentierades in vitro i grodden-liknande celler och tidiga oocyter steget ^12. Under differentiering den delmängd av de stamceller som uttrycker Oct4 ökat och strukturer som liknar cumulus-äggcell komplex bildades. Oocyten-liknande celler (OLCs) kan plockas från kulturerna och jämfört med naturliga oocyter. Med hjälp av denna OLCs kultur metod som mäter 40-45 nm erhålles som beskriver liknande markörer till oocyter såsom Gdf9b, VASA, och DAZL. Hittills de resulterande OLCs förblir oförmögen att mogna eller gödslas ^12.

Även de OLCs förblir oförmögen att fungera det protokoll som används för att bilda dessa OLCs fortfarande kan ha användbarhet som en analys för att undersöka bildandet och utvecklingen av tidigare celler arrangerar könsceller inom ett stängt in vitro-system. Den ursprungliga publikationen diskutera bildandet av OLCs från såtiska stamceller utnyttjas fostrets svinhud som en stamcell källa ^8. Expanderande på den studien PGC-liknande celler bildas tidigt under inducerad differentiering visade sig vara förstadier till OLCs och uttrycka sådana PGC markörer som Oct4, VASA, STELLA, C-KIT, och DAZL ^13. Dessa data stödjer potentialen att utnyttja detta system för att studera bildandet könsceller och differentiering in vitro. Protokollet används för att bilda OLCs från nyfödd mus hud kommer att demonstreras i denna video artikeln. Detta protokoll ger en in vitro-modell för att studera utvecklingen könsceller som kan vara ett sätt att belysa faktorer som viktiga för deras proliferation och differentiering.

Protocol

Ett. Media Preparation Förbered media 2-3 tim före användning och plats med ett lossat lock i cellodling inkubator där experimentet kommer att äga rum. Media som används i detta protokoll: Förbered stamceller medium bestående av DMEM/F12 kompletterat med 1 x B27, 40 ng / ml bFGF och 20 ng / ml EGF. Förbered groddar mediet celldifferentiering bestående av M199 supplementerat med 0,05 lU FSH, 0,03 lU LH, 3 mg / ml BSA, 5 | il / ml ITS, 0,23 mM natriumpyruvat, 1 mg / ml Fetuin, och 1…

Representative Results

Ursprungligen cellerna fäster till kulturen skålen botten och sprida ut. Vid 42-72 tim i differentiering små suspenderade Oct4 positiva celler bildas och föröka sig (Figur 1A). Strax efter visualisering av dessa celler majoriteten kommer att försvinna och de bifogade cellerna bildar täta kolonier aggregat på kulturen botten. Efter ett par dagar dessa aggregat kommer att lossna från odlingsytan. I vissa av dessa aggregat en stor cell kan observeras (Figur 1b och 1c).</st…

Discussion

Hittills funktionella OLCs inte har utvecklats med hjälp av en helt in vitro. Nyligen en studie av Hayashi et al. Kunde producera avkomma från PGC-liknande celler som bildas in vitro och överfördes in vivo för vidare utveckling ^14. Börjar med ES-celler eller inducerade pluripotenta de kunde bilda PGC liknande celler som, när de återvinns efter in vivo transplantation kunde vara mognat, gödslas, och används för att generera avkomma ^14. Detta vi…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Invitrogen	12500
B27	Invitrogen	17504044
EGF	Invitrogen	PHG0311
bFGF	Invitrogen	PHG0266
ITS	Invitrogen	41400-045
BSA	Sigma	A-6003
Sodium Pyruvate	Invitrogen	11360-070
Fetuin	Sigma	F3385
FSH	Sioux Biochemicals	915
LH	Sioux Biochemicals	925
M199	Invitrogen	31100-035
24 well plates	Nunc	144530
10 cm dishes	VWR	25384-088
15 ml tubes	BD	352095