Trypsin Digest protokollet för att analysera den Retinal kärlsystemet av en musmodell

Summary

Trypsin digest är en av de vanligaste metoderna för att analysera retinal kärlsystem. Detta manuskript beskriver metoden i detalj, inklusive viktiga förändringar för att optimera tekniken och ta bort icke-vaskulär vävnad samtidigt som den övergripande arkitekturen av fartygen.

Abstract

Trypsin Digest är guldmyntfoten metod för att analysera näthinnan kärlsystemet ^1-5. Det möjliggör visualisering av hela nätverk av komplexa tredimensionella retinala blodkärl och kapillärer genom att skapa en tvådimensionell platt-mount av sammanlänkade vaskulära kanalerna efter rötning av icke-vaskulära komponenter i näthinnan. Detta gör att man kan studera olika patologiska kärlförändringar, såsom microaneurysms, kapillär degeneration och onormal endotelceller att pericyter förhållanden. Emellertid är metoden tekniskt utmanande, särskilt i möss, som har blivit den mest tillgängliga djurmodell för att studera näthinnan på grund av den enkla genetiska manipulationer ^6,7. I musen ögat, är det särskilt svårt att helt ta bort de icke-vaskulära komponenter samtidigt som det övergripande arkitekturen av näthinnans blodkärl. Hittills finns det en brist på litteratur som beskriver trypsin smälta tekniken i detalj in musen. Detta manuskript ger en detaljerad steg-för-steg metod för trypsin smälta i mus näthinnan, och samtidigt ge tips om felsökning svåra steg.

Introduction

Visualisering vaskulaturen av näthinnan är en mycket viktig metod för att dissekera av mekanismen av olika ögonsjukdomar, såsom diabetisk retinopati. Det gör att man kan bedöma de tidigaste kärlmissbildningar, inklusive microaneurysms, kapillär degeneration och pericyter förlust ^8,9. Hittills har det funnits flera tekniker utvecklats för att analysera retinal kärlsystemet. Perfusion av olika färgämnen har använts för att belysa de fartyg, men alla har delat liknande begränsningar. Injektion belyser sällan hela retinal kärlsystemet inte ges vid ett högt tryck, vilket riskerar att spricka och skada fartyg ^1. Immunfärgning av vaskulär endotel med fluorofor-märkta G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 konjugerat, I21413, Invitrogen, 1:100 utspädning) och retinal platta fästen kan belysa den övergripande arkitekturen av fartygen, men utan detaljerad visualisering av kapillärer, basalmembran och pericyter . Det noterades avFriedenwald att fartygen kan belysas genom färgning platt-fästen av näthinnan med periodisk syra-Schiff (PAS) eller hematoxylin och eosin (H & E) färgning ^10. Dock var färgning ospecifik för fartygen och betonade icke-vaskulär vävnad också, vilket gör det svårt att skilja fartygen. Under 1960-talet utvecklades Cogan och Kuwabara trypsinet digest teknik som gjorde det lättare att visualisera näthinnan kärlsystemet genom uppslutning av nonvascular komponenterna i näthinnan ^1. Sedan dess har trypsin smälta blivit guldmyntfoten metoden att analysera kärlsystemet av näthinnan ^2-5. Det är dock viktigt att notera att andra alternativa tekniker för att isolera vaskulaturen har beskrivits. Användningen av osmotisk lys har använts för att isolera vaskulaturen och tillåta biokemiska studier av vävnad ^11,12, men förfarandet har inte använts som en primär metod för anatomisk studie. Vävnaden Tryckmetodenanvändes för att isolera stora delar av mikrovaskulatur och ger förmågan att studera electrotonic arkitekturen i vaskulaturen ^13. I teorin kan denna teknik också användas för att studera anatomiska förändringar, som kvaliteten på fartygen är hög. Det är dock endast kunde isolera segment av hela vaskulaturen nätverket. Även om dessa metoder inte kan ersätta trypsin smälta, är det viktigt att notera att de har olika fördelar och brister och kompletterar varandra i detta avseende.

Den trypsin digest metoden är tekniskt utmanande och är svår att utföra genomgående ^6,7. Vidare har det noterats att trypsin digest är särskilt svårt på en musmodell, särskilt om man önskar att upprätthålla den totala vaskulära arkitekturen av näthinnan ^6,7. Utmaningar inkluderar (1) over-rötning av näthinnan som orsakar förlust av både kärlsystemet samt icke-vaskulär vävnad, (2) under-matsmältning, kräveromfattande mekanisk dissektion vilket i sin tur kan leda till skador på fartyget sängen, (3) dålig separation av icke-vaskulär vävnad från kärlsystemet vilket leder till icke-specifik färgning. Flera manuskript har markerat dessa utmaningar, men ingen har gett en detaljerad och konsekvent protokoll för att övervinna dem ^14,15. Detta manuskript kommer att införa en steg-för-steg metod beskriver tekniken för att utföra trypsin smälta på mus och råtta näthinnor med specifika tips om hantering av särskilt svåra steg. En schematisk översikt visas i figur 1.

Protocol

Ett. Retinal Framställning Enucleate musen ögat. Använda en hand, öppna ögonlocken så att ögat är synlig. Med den andra handen, med en böjd pincett (böjda uppåt), utöva påtryckningar på högre och lägre aspekter av bana förrän Globe sticker. Stäng försiktigt pincett vid den bakre sidan av ögat och lyft i en kontinuerlig rörelse för att enucleate ögat. Fix ögat med 10% neutral buffrad formalin under minst 24 tim. Placera öga i PBS-lösning i en liten petriskål. </l…

Representative Results

Den slutliga produkten av en lyckad procedur är en platt-mount av hela nätverket av musen retinal kärlsystemet, med arkitekturen bibehålls, färgades med antingen PAS / hematoxylin eller H & E, som visas i figurerna 2-4. Klar differentiering av endotelceller och pericyter kan ses som visas i figur 3. I näthinnan, kärnorna av endotelceller är ovala eller avlånga och helhet ligga inom kärlväggen. Pericyter kärnor är små, sfäriska, bets tätt och i allmänhet har en utskj…

Discussion

Trypsin Digest är en standardmetod för att bedöma vaskulaturen av näthinnan. Tyvärr är det tekniskt utmanande och kan resultera i hög prov förlust om den inte utförs på rätt sätt. Vidare är förfarandet särskilt svår i möss, vilket kan begränsa tillämpningen av denna teknik i de vanligaste genetiska djurmodeller av ögonsjukdomar. Detta dokument ger vägledning om hur man ska utföra proceduren på ett effektivt och konsekvent i mus ögon.

Det finns flera viktiga steg i pro…

Materials

			REAGENTS
10% neutral buffered formalin	Fischer Scientific	SF100-4
Trypsin (1:250)	Amresco	0458-50G	Make 3% trypsin in 0.1 M Tris
TRIZMA base	Sigma	T1503-1KG	Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C)
TRIZMA	Sigma	T3253-500G
Steritop sterile vacuum bottle	Millipore	SCGPS05RE	Create filtered water
			EQUIPMENT
Dissecting microscope			Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm)
Straight scissors	Fine Science Tools	15024-10	Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm
Straight Forceps (Inox)	Dumont #5	11252-20	Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm
Curved Forcepts (Dumostar)	Dumont #7	11297-10	Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm
Dubnoff Metabolic Shaker Incubator	Precision Scientific	BDG59442	Shaker optional
24-well dish	Falcon	353047
Microscope Slides	VWR	82027-132