Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Resumo

Este documento revela um protocolo para caracterizar as propriedades mecânicas de células vivas por meio de microindentação utilizando um microscópio de força atómica (AFM).

Resumo

As propriedades mecânicas das células e da matriz extracelular (ECM) desempenham papéis importantes em muitos processos biológicos, incluindo a diferenciação de células estaminais, a formação de tumores e cicatrização de feridas. Alterações na rigidez de células e de ECM são frequentemente sinais de alterações na fisiologia da célula ou doenças em tecidos. Assim, a rigidez da célula é um índice para avaliar a qualidade de culturas de células. Entre a multiplicidade de métodos aplicados para medir a rigidez das células e tecidos, micro-recuo usando um Microscópio de Força Atômica (AFM) fornece uma maneira de medir de forma confiável a rigidez das células vivas. Este método tem sido amplamente utilizado para caracterizar a rigidez em micro-escala de uma variedade de materiais que vão desde as superfícies metálicas para os tecidos moles e as células biológicas. O princípio básico deste método é recuar um celular com uma ponta do AFM da geometria selecionada e medir a força aplicada a partir da flexão do cantilever AFM. Montagem da curva força-recuo para o modo de Hertzl para a geometria da ponta correspondente pode dar medições quantitativas de rigidez do material. Este documento revela o procedimento para caracterizar a rigidez de células vivas utilizando AFM. Etapas-chave, incluindo o processo de AFM calibração, aquisição de força curva, e análise de dados usando uma rotina MATLAB são demonstrados. As limitações deste método também são discutidos.

Introdução

As propriedades mecânicas, em especial a rigidez, de células individuais e as suas áreas de matrizes extracelulares (ECM) são críticos para muitos processos biológicos incluindo o crescimento celular, motilidade, divisão, diferenciação e na homeostase de tecido. ^Uma Foi demonstrado que a rigidez mecânica da célula é determinada principalmente pela do citoesqueleto, em particular as redes de filamentos de actina e intermédios e outras proteínas associadas a eles. ² Resultados dos testes mecânicos nas redes em in vitro de filamentos de actina e intermediários sugerem que os mecanismos celulares é em grande parte dependente da estrutura do....

Protocolo

1. Calibrar a constante da mola do cantilever

1. Carregar o cantilever na AFM de acordo com as instruções do fabricante. É necessário limpar o titular do cantilever com etanol antes de todas as experiências. Isto irá ajudar a limitar a contaminação da cultura bacteriana durante as medidas de AFM.
2. Calibrar InvOLS (sensibilidade Lever Optical Inverse). Este parâmetro descreve a quantidade de resposta do fotodiodo (Volts) por nanómetro de deflexão do cantilever.
3. Coloque uma lâmina de vidro limpa para o estágio da amostra, em seguida, instala na cabeça AFM e ajustar o alinhamento do feixe de laser e de acordo com as instruções do fabricante. E....

Resultados

A Figura 2a mostra três curvas representativas força tomadas a partir de fibroblastos 3T3 cultivadas na superfície de plástico, em gel de poliacrilamida de módulos de Young 3000 Pa e 17.000 Pa, respectivamente. Depois de identificar cuidadosamente os pontos de contacto nas curvas, a força de recuo em função da deformação celular está representada na Figura 2b. Sob uma força de magnitude menor do que 0,3 nN, uma pirâmide de forma da ponta travessões 3 micrômetros em uma célula cultivadas.......

Discussão

O método de recuo AFM tem vantagens para caracterizar as propriedades mecânicas de células vivas. Embora menos sensível do que a citometria de torção magnética e pinças ópticas, que pode medir forças no nível piconewton ^32, o AFM pode detectar a força de resistência de amostras variando de dezenas de pico-Newton para centenas de nano-Newton, comparáveis ​​a gama de força que pode ser aplicado a células utilizando uma micropipeta ^19. Esta gama de força se adapta às necessidades de criar deformações .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscópio de Força Atômica	Asylum Research	MFP3D-BIO