재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 Agroinfiltration
Summary
식물은 현재의 표현 패러다임을보다 더 확장 가능한 비용 효율적이고 안전 상업적 규모에 제약 단백질의 생산을위한 새로운 시스템을 제공합니다. 본 연구에서는, 우리는 포함하는 대상 유전자를 소개하는 간단하고 편리하면서도 확장 가능한 접근 방법을보고<em> 아그로 박테 리움</em> 단백질의 과도 발현 식물에.
Abstract
포유류 세포 배양 인간 백신과 치료 단백질의 상업 생산을위한 주요 플랫폼입니다. 그러나, 제한된 확장 성 및 높은 비용으로 인해 의약품에 대한 증가하는 세계적 수요를 충족 할 수 없습니다. 식물은 강력하고, 확장 성, 저렴한 비용과 안전한 가장 유망한 대체 의약품 생산 플랫폼 중 하나가 될 것으로 나타났습니다. 바이러스 기반 벡터의 최근 발전은 식물에서 재조합 단백질의 신속하고 높은 수준의 일시적인 표현을 허용했다. 또한 과도 발현 시스템의 유틸리티를 최적화하기 위해, 우리는이 연구에서 식물 조직에 표적 유전자가 포함 아그로 박테 리움을 소개하는 간단하고 효율적이며 확장 가능한 방법을 보여줍니다. GFP와는 DsRed, 우리의 결과는 방법은 잎 두 형광 단백질의 강력한 생산에 아그로 박테 리움의 효율적인 도입에 성공 주사기, 진공 모두에 해당 agroinfiltration을 나타냅니다. 또한,우리는 두 가지 방법으로 제공하는 독특한 장점을 보여줍니다. 주사기 침투가 간단하고 고가의 장비를 필요로하지 않습니다. 또한 유연성 하나 표적 유전자의 전체 휴가를 침투하거나 하나의 잎에 여러 대상의 유전자를 도입 할 수 있습니다. 따라서,이 재조합 단백질의 실험실 규모의 발현뿐만 아니라 수확량 또는 식 속도론에 대해 서로 다른 단백질이나 벡터를 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 주사기 침투의 단순함은 생명 공학의 주제에 대한 고등학교와 대학 교육의 실용성을 제안한다. 반면, 진공 침투는 더 강력하고 제약 단백질의 상업적 제조를위한 스케일 업 할 수 있습니다. 그것은 또한 양상추와 애기 장대와 같은 주사기 침투에 대한 의무가없는 식물 종을 agroinfiltrate 할 수 있다는 장점을 제공합니다. 전반적으로, 주사기 및 진공 agroinfiltration의 조합은 연구자와 교육자를 제공하는, 간단하고 효율적이며 강력한과도 단백질 발현을위한 방법론. 그것은 크게 제약 단백질의 개발을 촉진하고 과학 교육을 추진합니다.
Introduction
1970 년대 이후, 식물 재조합 단백질 및 단백질 치료제 1의 상업 생산을위한, 포유 동물 곤충 및 세균 세포 배양에 대한 대안으로 모색되고있다. 바이오 의약품의 표현을위한 식물 기반 시스템은 임상 시험에서 성공을 보여, 고셔병의 질병 2, 조류 H5N1 독감 3과 같은 질병에 대한 몇 가지 새로운 치료법으로 최근 몇 년 동안 약속을 보여 주었다. 이러한 초기 실험 이후 수십 년 동안 공장에서 재조합 단백질 발현 능력 메커니즘의 개발은 세 가지 주요 이유로 단백질 생산의 현재 패러다임을 변경하는 식물 기반 시스템의 가능성을 만들었습니다. 첫째, 포유류 곤충, 및 세균 바이오 리액터 상당한 초기 비용, 비싼 성장 매체와 하류 정화 4 복잡한 과정을 필요로 비용 주목할만한 감소가있다. 안정적인 형질 전환 식물의 생성라인은 또한 단백질 발현 식물이 재배 농업 규모 5에 수확 할 수로 다른 표현 시스템의 확장 성을 능가 할 수 있습니다. 둘째, 식물 기반의 발현 시스템은 크게 공공 안전 6 우수성을 보여주는, 인간 단백질 발현 호스트에서 사람 또는 동물 병원체 전송의 위험을 줄일 수 있습니다. 마지막으로, 식물은 당화와 여러 소단위 단백질 7의 조립을 포함한 단백질의 적절한 번역 후 수정을 허용하는, 포유 동물 세포와 유사한 진핵 endomembrane 시스템을 사용합니다. 이 기능은 더 복잡한 구조를 가지고 광범위한 전사 후 수정 또는 어셈블리 8가 필요 단클론 항체 (드을) 등의 제약 재조합 단백질의 넓은 수 있기 때문에, 박테리아와 같은 원핵 생물 시스템에 따라 그 앞두고 식물 기반 시스템을 넣습니다.
두 가지 주요 APPRO이 있습니다식물에서 재조합 단백질을 발현에 아파. 첫 번째는 대상 단백질 코딩 DNA가 발현 카세트에 복제 및 핵 또는 엽록체 게놈 중 하나에 도입 안정적으로 형질 전환 라인의 개발이다. 이 과정에서 외국의 DNA가 다음 세대를 통해 유전되고 지금까지 다른 발현 시스템 1을 넘어, 엄청난 확장 성이 향상 할 수 있습니다. 핵 게놈에 외래 DNA의 도입은 일반적으로 조직 9 microprojectile 폭격에 의해, 덜 자주, 식물 조직의 아그로 박테 리움 감염에 의해 달성되거나. 식물 호르몬은 그 차별화와 뿌리와 잎 같은 형질 전환 식물 조직의 성장을 유도하는 데 사용됩니다. 엽록체 게놈의 변환은 A. 달성 할 수 없다 DNA로 코팅 박테 리움하지만, 금 또는 텅스텐 입자에 전적으로 의존 식물 세포로 탄도 발사. 재조합을 표현하는 두 번째 방법은식물 NT 단백질은 과도 표현을 통해 10입니다. 이 시나리오에서, 관심의 유전자를 품고 바이러스 유래 벡터는 A. 통해 전달됩니다 과정을 통해 완전히 개발 식물 박테 리움은 agroinfiltration을했다. 대신에 식물의 게놈에 통합으로, 전달 된 유전자 구조는 짧은 잠복기 후 수확하고 분리 할 수 있습니다 원하는 단백질의 과도 생산을 지시하기 시작합니다. 식물 agroinfiltration 11 후 약 1-2 주를 수확 할 준비가 일시적인 유전자 발현은 큰 전체 단백질 축적뿐만 아니라 단백질의 생산 시간을 단축의 이점을 제공합니다. 이 1 년 몇 개월이 걸릴 수있는 안정적인 형질 전환 식물 라인의 생성, 선택 및 확인 프로세스보다 훨씬 빠릅니다. 이 유전자 안정적인 공장 리튬을 얻을하지 않으므로 그러나, 이것은 또한 일시적인 발현 시스템의 한계입니다대규모 상업 생산을위한 종자 은행을 생성 할 수 있습니다 NES. 그럼에도 불구하고, 접근 방식은 대규모의 일시적 발현을 개선하기 위해 개발되었습니다. 여기에서 우리는 A.에 의해 전달 해체 바이러스 벡터를 사용하여 과도 단백질 발현은 Nicotiana benthamiana 공장의 생성하는 한 가지 방법을 보여 박테 리움.
두 가지 주요 방법은 A.의 배달을 위해 개발되고있다 식물 조직에 박테 리움 : 진공 챔버를 통해 주사기와 대규모 침투를 통해 벤치 스케일 침투. 두 프로토콜은 N.를 사용하여 여기에 설명되어 있습니다 밀접 일반 담배 공장과 관련된 benthamiana, 두 형광 단백질의 과도 발현 기주 식물로 : 해파리 Aequorea 빅토리아 Discosoma 산호 (는 DsRed) 12,13에서 붉은 형광 단백질의 녹색 형광 단백질 (GFP). N. benthamiana에 대한 가장 일반적인 호스트 식물그것은 유전자 변형 의무가 있기 때문에 재조합 단백질은 빠르게 바이오 매스의 높은 금액을 산출하고, 스케일 업 생산 14 다작 종자 생산자 수 있습니다. N. 사용의 또 다른 이점 단백질 발현을위한 호스트로 benthamiana는 발현 벡터 2.5의 다양한 가용성이다. 본 연구에서는 두 해체 바이러스 성 벡터, 담배 모자이크 바이러스 (TMV) RNA의 replicon 시스템 (MagnICON 벡터)와 빈 노란색 난쟁이 바이러스 (BeYDV) DNA의 replicon 시스템 (geminiviral 벡터) 4,11에서 파생 된 다른 기준으로 한 15-18는 GFP와는 DsRed 유전자를 운반 N.에 그들을 제공하는 데 사용됩니다 A. 통해 benthamiana 세포 박테 리움. 세 DNA의 구조는 GFP 또는 MagnICON 벡터와는 DsRed 표현에 사용됩니다. 그들은 관심의 유전자를 포함하는 모듈 (PICH 5 '대상 유전자 3의 발현 운전 발기인 및 기타 유전 적 요소를 포함하는 모듈 (pICH15879)'을 포함- GFP 또는 PICH-는 DsRed) 및 integrase 모듈 (pICH14011)는 expression 8,15에 5 '와 3'모듈을 함께를 통합하는 효소를 코딩. 세 DNA의 구조는 geminiviral 벡터를 표현 필요합니다. 표적 유전자 (pBYGFP 또는 pBYDsRed)의의 replicon를 포함하는 벡터뿐만 아니라, 복제 단백질 (pREP110)에 대한 코딩 벡터는 대상의 replicon 11,14,16의 증폭이 필요합니다. 또한, 토마토 덤불 스턴트 바이러스에서 침묵 억압 P19 인코딩 벡터의 포함은 높은 수준의 목표 유전자의 발현 11,16 위해 원하는.
식물의 성장, A. 등 agroinfiltration에 의해 식물 세포에 재조합 단백질의 유전자의 도입을위한 세 가지 주요 단계는 일반적으로있다 박테 리움 문화 준비 및 침투. 각 단계마다이 절차의 궁극적 인 성공에 중요한이기 때문에, 따라서 자세한 설명이 제공됩니다주사기 침투 아래 진공 침투 모두.
Protocol
Representative Results
Discussion
단백질 기반의 의약품에 대한 증가하는 요구는 전 세계적으로 강력하고, 확장 성, 저렴한 비용과 안전한 새로운 생산 플랫폼을 필요로합니다. 식물은 제약 단백질 생산을위한 가장 유망한 대체 생산 시스템 중 하나가 될 것으로 나타났습니다. 최근 몇 년 동안, 해체 바이러스 기반 벡터의 개발은 크게 속도와 식물 발현 시스템 2,10의 수율을 향상 식물에서 단백질의 일시적인 표현을 사용?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 R. 태양과 기여에 대한 첸의 연구실의 학생들은 물질 생성을 심어 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 기술과 혁신 (CTI)의 대학 학부 연구의 그의 지원을 위해 박사 D. 녹색 감사합니다. 이 연구는 Q. 첸에 NIH 보조금 U01 AI075549 및 1R21AI101329, 그리고 Q. 첸 애리조나 주립 대학의 CTI에서 SSE 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다. K. Leuzinger, M. 덴트, J. Hurtado, 그리고 J. Stahnke는 SSE 지원에 의하여 학부생입니다.
Materials
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson & CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson & CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8″ with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
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