Effiziente Agroinfiltration von Pflanzen für High-Level-Transient Expression von rekombinanten Proteinen
Summary
Pflanzen bieten ein neuartiges System für die Produktion von pharmazeutischen Proteinen in einem kommerziellen Maßstab, die besser skalierbare, kosteneffiziente und sichere als aktuellen Ausdruck Paradigmen ist. In dieser Studie berichten wir über eine einfache und bequeme, aber skalierbaren Ansatz zur Ziel-Gen enthält, einführen<em> Agrobacterium tumefaciens</em> In Anlagen zur Protein transiente Expression.
Abstract
Säugerzellen ist das wichtigste Plattform für die kommerzielle Produktion von menschlichen Impfstoffen und therapeutischen Proteinen. Allerdings kann es nicht die steigende weltweite Nachfrage nach Arzneimitteln wegen seiner begrenzten Skalierbarkeit und hohe Kosten. Pflanzen haben gezeigt, dass eine der vielversprechendsten alternativen pharmazeutischen Produktion Plattformen, die robuste, skalierbare, kostengünstige und sicher sind. Die jüngste Entwicklung von Virus-basierten Vektoren hat rasche und High-Level transiente Expression von rekombinanten Proteinen in Pflanzen erlaubt. Zur weiteren Optimierung der Nützlichkeit des transienten Expressionssystem zeigen wir eine einfache, effiziente und skalierbare Methode zur Target-Gen, das in Agrobacterium Pflanzengewebe einzuführen in dieser Studie. Unsere Ergebnisse zeigen, dass sowohl mit Agroinfiltration Spritze und Vakuumverfahren bei der effizienten Einführung von Agrobacterium in Blätter und robuste Produktion von zwei fluoreszierenden Proteinen geführt haben; GFP und DsRed. Fernerdemonstrieren wir die einzigartigen Vorteile von beiden Methoden angeboten. Spritze Infiltration ist einfach und braucht keine teure Ausrüstung. Es ermöglicht auch die Flexibilität, um entweder die gesamte infiltrieren verlassen mit einem Ziel-Gen oder von Genen von mehreren Zielen auf ein Blatt einzuführen. So kann es für Labormaßstab Expression rekombinanter Proteine sowie für den Vergleich verschiedener Proteine oder Vektoren für die Ausbeute oder Expressionskinetik verwendet werden. Die Einfachheit der Spritze Infiltration schlägt auch ihre Nutzbarkeit in der High School und College-Ausbildung für das Fach Biotechnologie. Im Gegensatz dazu ist Vakuuminfiltration robuster und Scale-Up für die kommerzielle Herstellung von pharmazeutischen Proteinen. Es bietet auch den Vorteil, dass sie in der Lage, Pflanzenarten, die nicht zugänglich sind für Spritze Infiltration wie Salat und Arabidopsis agroinfiltrate. Insgesamt bietet die Kombination aus Spritze und Vakuum Agroinfiltration Forscher und Pädagogen eine einfache, effiziente und robusteMethodik für die transiente Proteinexpression. Es wird dadurch wesentlich erleichtert die Entwicklung von pharmazeutischen Proteinen und Förderung von Wissenschaft Bildung.
Introduction
Seit den 1970er Jahren haben die Pflanzen als Alternative zu Säugetier-, Insekten-und bakteriellen Zellkulturen für die kommerzielle Produktion von rekombinanten Proteinen und Protein-Therapeutika 1 untersucht. Plant-basierte Systeme für die Expression von Biopharmazeutika haben Versprechen in den letzten Jahren als mehrere neue Behandlungen für Krankheiten, wie Morbus Gaucher 2 und aviäre Influenza H5N1 3 dargestellt ist, haben gezeigt, Erfolg in klinischen Studien. Die Entwicklung von Mechanismen für die zuständigen Expression rekombinanter Proteine in Pflanzen in den Jahrzehnten seit den ersten Versuchen hat das Potenzial für eine Anlage-basierte Systeme, um die aktuelle Paradigma der Protein-Produktion für drei Hauptgründe verändern erstellt. Erstens gibt es eine bemerkenswerte Abnahme der Kosten als Säugetier-, Insekten und Bakterien Bioreaktoren erfordern erhebliche Anlaufkosten, teure Nährmedien und komplizierte Prozesse für Downstream-Reinigung 4. Die Schaffung von stabilen transgenen PflanzeLinien ermöglicht ihnen auch die Skalierbarkeit der Systeme übertreffen anderen Ausdruck als Protein exprimieren Pflanzen angebaut und geerntet werden in einem landwirtschaftlichen Skala 5. Zweitens, auf pflanzlicher Basis Ausdruck Systeme deutlich reduzieren das Risiko der Übertragung eines menschlichen oder tierischen Erreger aus dem Protein-Expression Host für den Menschen, zeigt Überlegenheit in der öffentlichen Sicherheit 6. Schließlich verwenden Pflanzen einen eukaryotischen Endomembransystem ähnlich Säugerzellen ist, für eine angemessene posttranslationale Modifikation von Proteinen einschließlich Glycosylierung und der Zusammenbau von mehreren Untereinheit Proteine 7. Diese Fähigkeit bringt pflanzliche Systeme vor solche auf Basis von prokaryotischen Systemen, wie Bakterien, da eine größere Anzahl von pharmazeutischen rekombinanten Proteinen, einschließlich monoklonale Antikörper (mAbs), eine kompliziertere Struktur und erfordern umfangreiche posttranslationale Modifikationen oder Anordnung 8.
Es gibt zwei große entspreschmerzt zu Expression rekombinanter Proteine in Pflanzen. Die erste ist die Entwicklung einer stabilen transgenen Linie, wobei DNA, die für das Zielprotein in eine Expressionskassette kloniert und eingeführt, um die Kern-oder Chloroplastengenome nicht. Dabei wird die Fremd-DNA durch die nachfolgenden Generationen vererbbar und ermöglicht enorm verbesserte Skalierbarkeit, weit über die anderer Expressionssysteme 1. Einführung von exogener DNA in das Kerngenom wird normalerweise durch Agrobacterium tumefaciens Infektion von Pflanzengewebe erreicht oder, seltener, durch Mikroprojektilbeschuss des Gewebes 9. Pflanzenhormone werden dann verwendet, um die Differenzierung und das Wachstum von transgenen Pflanzengewebe wie Wurzeln und Blätter zu induzieren. Transformation des Chloroplasten-Genom nicht erreicht werden A. tumefaciens, sondern verlässt sich ganz auf Gold-oder Wolfram-Partikel mit DNA beschichtet gefeuert ballistisch in Pflanzenzellen. Das zweite Verfahren zur Expression Rekombinationnt-Protein in Pflanzen durch transiente Expression 10. In diesem Szenario werden Virus-abgeleiteten Vektoren, die das Gen von Interesse via A. geliefert tumefaciens zu voll entwickelten Pflanzen durch einen Prozess namens Agroinfiltration. Statt der Integration in das pflanzliche Genom, wird die gelieferte Genkonstrukt dann damit beginnen, die transiente Produktion des gewünschten Proteins, die geerntet und nach kurzer Inkubationszeit isoliert werden zu lenken. Transient Genexpression bietet den Vorteil einer größeren allgemeinen Protein-Akkumulation sowie einer verbesserten Zeit von Protein-Produktion, wie die Pflanzen bereit sein wird, ca. 1-2 Wochen nach Agroinfiltration 11 ernten. Dies ist deutlich schneller als die Prozesse der Erzeugung, Auswahl und Bestätigung von stabilen transgenen Linien, die mehrere Monate dauern kann bis zu einem Jahr. Dies ist aber auch die Begrenzung der transienten Expressionssystem, da es nicht ergeben genetisch stabile Anlage lines, die verwendet werden, um eine Samenbank für groß angelegte kommerzielle Produktion erzeugen kann. Trotzdem haben Ansätze entwickelt worden, um in großem Maßstab transiente Expression zu verbessern. Hier zeigen wir eine Methode zur Erzeugung von transienten Protein-Expression Nicotiana benthamiana Pflanzen mittels viraler Vektoren dekonstruiert von A. geliefert tumefaciens.
Zwei wichtige Methoden werden für die Lieferung von A. entwickelt tumefaciens in Pflanzengewebe: bench scale Infiltration über eine Spritze und große Infiltration über Vakuumkammer. Beide Protokolle werden hier mit N. beschrieben benthamiana, die eng mit der gemeinsamen Tabakpflanze verwandt ist, als Wirtspflanze für transiente Expression von zwei fluoreszierende Proteine: das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus Qualle Aequorea victoria und der rot fluoreszierendes Protein aus Discosoma Koralle (DsRed) 12,13. N. benthamiana ist die häufigste Wirtspflanzerekombinantes Protein, weil es zugänglich für genetische Transformation ist, können große Mengen an Biomasse rasch ergeben, und ist ein überaus produktiver Saatguthersteller für Scale-up-Produktion 14. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von N. benthamiana als Gastgeber für die Proteinexpression ist die Verfügbarkeit einer Vielzahl von Expressionsvektoren 2,5. In dieser Studie wurden zwei dekonstruiert virale Vektoren, eine auf einer Tabak-Mosaik-Virus (TMV) RNA Replikon System (magnICON Vektoren) und die andere von der Bohne yellow dwarf virus (BeYDV) DNA Replikon System (geminiviral Vektoren) 4,11 ermittelt, die 15-18, werden verwendet, um die GFP und DsRed-Gen tragen und sie geben in N. benthamiana Zellen über A. tumefaciens. Drei DNA-Konstrukte für GFP oder DsRed Expression mit magnICON Vektoren verwendet werden. Dazu gehören das 5'-Modul (pICH15879), das den Promotor und andere genetische Elemente für den Antrieb der Expression des Ziel-Gens, das 3'-Modul, das das Gen von Interesse (PICH-GFP oder PICH-DsRed) und der Integrase-Modul (pICH14011) für ein Enzym codiert, das die 5 'und 3'-Module miteinander integriert bei Expression 8,15. Drei DNA-Konstrukte werden auch für die Expression mit geminiviral Vektoren benötigt. Zusätzlich zu Vektoren, die Replikon des Zielgens (pBYGFP oder pBYDsRed) ist ein Vektor, der für die Replikation Protein (pREP110) für die Amplifikation der Ziel-Replikon 11,14,16 erforderlich. Darüber hinaus ist die Einbeziehung eines Vektors Codieren des Silencing Suppressor p19 aus Tomate buschigen stunt virus für hohe Zielgenexpression 11,16 gewünscht.
Im Allgemeinen gibt es drei wesentliche Schritte zur Einführung von Genen von rekombinanten Proteinen in Pflanzenzellen durch Agroinfiltration einschließlich Pflanzenwachstums, A. tumefaciens Kultur Vorbereitung und Infiltration. Da jeder Schritt ist entscheidend für den letztendlichen Erfolg dieses Verfahrens daher wird eine detaillierte Beschreibung für jede vorgesehen istsowohl für Spritze Infiltration und Vakuuminfiltration unten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die steigenden Anforderungen an die Protein-basierten Pharmazeutika weltweit erfordern neue Produktion Plattformen, die robuste, skalierbare, kostengünstige und sicher sind. Pflanzen haben gezeigt, dass eine der vielversprechendsten alternativen Produktionssystemen für Herstellung pharmazeutischer Proteine sein. In den letzten Jahren wurde die Entwicklung von deconstructed Virus basierende Vektoren transienten Expression von Proteinen in Pflanzen, die eine wesentliche Steigerung der Geschwindigkeit und Ausbeute …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken R. Sun und andere Studenten von Chens Labor für ihren Beitrag zur Material-Generation zu pflanzen. Wir danken auch Dr. D. Green für seine Unterstützung von Bachelor-Forschung in der Hochschule für Technik und Innovation (KTI). Diese Forschung wurde teilweise durch Zuschüsse NIH U01 AI075549 und 1R21AI101329 zu Q. Chen und eine SSE Zuschuss von CTI der Arizona State University auf Q. Chen unterstützt. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado und J. Stahnke sind Studenten von der SSE Zuschuss unterstützt.
Materials
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson & CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson & CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8″ with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
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