류신 리치의 신진 대사 라벨링 방사성 인산과 키니 아제 1과 2를 반복
Summary
류신이 풍부한 반복 키나아제 1 및 2 (LRRK1 및 LRRK2는) GTPase의 키나제 도메인을 모두 인코딩 세포에서 인산화되는 멀티 도메인 단백질입니다. 여기, 우리는 따라서 전반적인 휴대 phophorylation 수준을 측정 할 수있는 수단을 제공, 32 P 오르토와 세포 LRRK1 및 LRRK2 레이블을하는 프로토콜을 제시한다.
Abstract
류신 풍부 반복 키나아제 1 및 2 (LRRK1 및 LRRK2)는, 세린 – 트레오닌 키나아제 복잡한 단백질 도메인의 라스 (ROC), ROC 도메인 (COR)의 C-말단을 포함하여, 유사 도메인 조직을 나누어 paralogs 아르 류신이 풍부한 및 N-말단에 ankyrin 같이 반복. LRRK1 및 LRRK2의 정확한 세포의 역할은 LRRK2는 파킨슨 병 3,4의 병인에 관여하는 동안 그러나 LRRK1가, 1,2 신호 티로신 키나제 수용체에 연루되어, 설명 될 못하고있다. 이 보고서에서, 우리는 따라서 세포에있는이 두 단백질의 전체 인산화 수준을 측정 할 수있는 방법을 제공하고, 32 P 오르토와 셀의 LRRK1 및 LRRK2 단백질 레이블을하는 프로토콜을 제시한다. 요컨데, 궁합 LRRK 단백질이 32 P-오르토 포스페이트를 함유하는 배지에 노출 HEK293T 세포에서 발현되는 태그. 32 P-인산염은 후 세포에 의해 흡수되어 단 몇배양 시간과 인산염이 들어있는 셀의 모든 분자함으로써 방사성 표시되어 있습니다. 선호도 태그를 통해 (3xflag) LRRK 단백질은 면역에 의해 다른 세포 구성 요소에서 격리됩니다. 면역 침전물이 후, SDS-PAGE를 통해 분리, PVDF 멤브레인 및 통합 된 인산염의 분석에 도말는 말에 단백질의 오토 라디오 그래피 (32 P 신호)와 서부 검출 (단백질 신호)에 의해 수행된다. 프로토콜은 쉽게 세포에서 발현 및 면역 침전에 의해 단리 될 수있는 임의의 다른 단백질의 인산화를 모니터링하도록 구성 될 수있다.
Introduction
류신이 풍부한 반복 키나아제 1 및 2 (LRRK1 및 LRRK2)는 유사한 도메인 조직을 공유하는 멀티 도메인 paralogs 있습니다. 이 두 단백질은 효과적으로 ROCO 단백질 가족 5,6에 두 단백질을 분류, GTPases (복합 단백질의 라스, 또는 ROC)의 라스의 가족뿐만 아니라 ROC 도메인 (COR)의 C-말단에 가까운 GTPase의 시퀀스를 인코딩합니다. 만 LRRK2 여분 딜 domein 6-8을 인코딩하는 동안 ROC-COR 도메인 직렬의 N-말단이 두 단백질은 류신이 풍부한 반복 도메인뿐만 아니라 ankyrin 같은 도메인을 인코딩합니다. 만 LRRK2는 C-말단 부위 8 WD40 도메인을 인코딩하는 동안 ROC-COR의 C-말단, 두 단백질은 세린 트레오닌 키나제 도메인을 공유 할 수 있습니다. LRRK1 및 LRRK2의 정확한 세포의 역할은, 그러나 LRRK1 1,2 신호 티로신 키나제 수용체에 연루되어, 설명 될 아직 동안 파킨슨 병 3,4의 병인에 LRRK2의 역할에 대한 유전 적 증거를 가리 킵니다.
<p클래스 = "jove_content"> 단백질의 인산화는 세포의 일반적인 규제 메커니즘입니다. 예를 들어, 인산화 효소의 활성화를 위해 또는 신호의 복잡한 단백질의 모집을 위해 필수적 일 수있다. LRRK2의 세포 인산화 광범위 특징으로되어 phosphosite 매핑은 ankyrin 반복과 류신이 풍부한 반복 도메인 9-11 사이의 클러스터에서 발생하는 세포의 인산화 사이트의 대부분을 보여 주었다. LRRK1 세포 인산화 사이트를 매핑 할 수 아직 가지고 있지만, COS7 세포에서 면역 침전 LRRK1 단백질의 말의 인 단백질 염색법을 사용하여 연구의 증거가 LRRK1 단백질은 셀 (12)의 인산화 것을 제안합니다.이 논문은 32 P-인산염과 신진 대사 라벨을 사용하여 세포 라인에 LRRK1 및 LRRK2의 일반 인산화 수준을 시금위한 기본 프로토콜을 제공합니다. 전반적인 전략은 간단합니다. 궁합 LRRK의 PROTE 태그인은 32 P-오르토 포스페이트를 함유하는 배지에 노출 HEK293T 세포에서 발현된다. 32 P-인산염이 단 몇 배양 시간과 인산염이 들어있는 셀의 모든 분자 후 세포에 의해 동화함으로써 방사성 표시되어 있습니다. 선호도 태그 (3xflag는) 다음 면역에 의해 다른 세포 구성 요소의 LRRK 단백질을 분리하는 데 사용됩니다. 면역 침전물이 후, SDS-PAGE를 통해 분리, PVDF 멤브레인 및 통합 된 인산염의 분석에 도말는 말에 단백질의 오토 라디오 그래피 (32 P 신호)와 서부 검출 (단백질 신호)에 의해 수행된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문은 32 P-인산염과 신진 대사 라벨을 사용하여 세포 라인에 LRRK1 및 LRRK2의 일반 인산화 수준을 시금위한 기본 프로토콜을 제공합니다. 전반적인 전략은 간단합니다. 궁합 LRRK 단백질이 32 P-오르토 포스페이트를 함유하는 배지에 노출 HEK293T 세포에서 발현되는 태그. 32 P-인산염이 단 몇 배양 시간과 인산염이 들어있는 셀의 모든 분자 후 세포에 의해 동화함으로써 방사…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 또한이 연구를 지원하는 마이클 J. 폭스 재단에 감사하고 있습니다. 플랑드르 FWO (FWO 프로젝트 G.0666.09, JMT에 선임 연구원의 교제), IWT SBO/80020 프로젝트 신경 TARGET, KU 루뱅 (OT/08/052A 및 IOF-KP/07 / 001) – 우리는 연구 재단 감사 자신의 지원. 이 연구는 또한 JMT은 킹 보두앵 재단에 의해 관리되는 기금 Druwé-Eerdekens에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11971-025 | This medium contains no phosphates |
| Anti Flag M2 affiinty gel | Sigma | A2220 | For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426. |
| Extra thick blotting filter | Bio-Rad | 1703965 | |
| Ponceau S solution | Sigma | P7170 |
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