Leucine रिच के चयापचय लेबल रेडियोधर्मी फास्फेट के साथ Kinases 1 और 2 दोहराएँ
Summary
Leucine संपन्न दोहराने kinases 1 और 2 (LRRK1 और LRRK2) GTPase और kinase डोमेन दोनों सांकेतिक शब्दों में जो और कोशिकाओं में phosphorylated हैं जो multidomain प्रोटीन होते हैं. यहाँ, हम जिससे उनके समग्र सेलुलर phophorylation के स्तर को मापने के लिए एक साधन उपलब्ध कराने, 32 पी orthophosphate साथ कोशिकाओं में LRRK1 और LRRK2 लेबल करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
Leucine संपन्न दोहराने kinases 1 और 2 (LRRK1 और LRRK2), एक सेरीन-threonine kinase डोमेन, जटिल प्रोटीन डोमेन का रास (ROC), आरओसी डोमेन (कोर) की एक सी टर्मिनल सहित, एक समान डोमेन संगठन का हिस्सा है जो paralogs हैं और leucine संपन्न और एन टर्मिनस पर ankyrin की तरह दोहराता. LRRK1 और LRRK2 के सटीक सेलुलर भूमिकाओं LRRK2 पार्किंसंस रोग 3,4 के रोगजनन में फंसा है, जबकि हालांकि LRRK1, 1,2 संकेत tyrosine kinase रिसेप्टर में फंसाया गया है, स्पष्ट होना शेष है. इस रिपोर्ट में, हम इस तरह की कोशिकाओं में इन 2 प्रोटीन के समग्र phosphorylation के स्तर को मापने के लिए एक साधन उपलब्ध कराने, 32 पी orthophosphate साथ कोशिकाओं में LRRK1 और LRRK2 प्रोटीन लेबल के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. संक्षेप में, आत्मीयता LRRK प्रोटीन 32 पी orthophosphate युक्त मध्यम के संपर्क में हैं जो HEK293T कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं टैग किया. 32 पी orthophosphate के बाद कोशिकाओं से ग्रहण कर लेता है केवल कुछऊष्मायन के घंटे और फॉस्फेट युक्त कक्ष में सभी अणुओं जिससे radioactively लेबल रहे हैं. आत्मीयता टैग के माध्यम से (3xflag) LRRK प्रोटीन immunoprecipitation द्वारा अन्य सेलुलर घटकों से अलग कर रहे हैं. Immunoprecipitates तो एसडीएस पृष्ठ के माध्यम से अलग हो रहे हैं, PVDF झिल्ली और शामिल फॉस्फेट का विश्लेषण करने के लिए मिट blots पर प्रोटीन की autoradiography (32 पी संकेत) और पश्चिमी पहचान (प्रोटीन संकेत) द्वारा किया जाता है. प्रोटोकॉल तत्काल कोशिकाओं में व्यक्त की और immunoprecipitation से अलग किया जा सकता है कि किसी भी अन्य प्रोटीन की phosphorylation की निगरानी करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Introduction
Leucine संपन्न दोहराने kinases 1 और 2 (LRRK1 और LRRK2) एक समान डोमेन संगठन का हिस्सा है जो multidomain paralogs हैं. दोनों प्रोटीन प्रभावी रूप से ROCO प्रोटीन परिवार 5,6 करने के लिए दोनों प्रोटीन वर्गीकृत, GTPases (प्रोटीन जटिल का रास, या आरओसी) के रास परिवार के साथ ही आरओसी डोमेन (कोर) की एक सी टर्मिनल के सदृश एक GTPase अनुक्रम सांकेतिक शब्दों में बदलना. केवल LRRK2 एक अतिरिक्त वर्मी domein 6-8 encodes जबकि रूह भ्रष्टाचार डोमेन मिलकर की एन टर्मिनल, दोनों प्रोटीन, एक leucine संपन्न दोहराने डोमेन के साथ ही एक ankyrin तरह डोमेन सांकेतिक शब्दों में बदलना. केवल LRRK2 सी टर्मिनल क्षेत्र 8 में एक WD40 डोमेन encodes जबकि रूह भ्रष्टाचार के सी टर्मिनल, दोनों प्रोटीन एक सेरीन-threonine kinase डोमेन का हिस्सा. LRRK1 और LRRK2 के सटीक सेलुलर भूमिकाओं, हालांकि LRRK1 1,2 संकेत tyrosine kinase रिसेप्टर में फंसाया गया है, स्पष्ट होना शेष है जबकि पार्किंसंस रोग 3,4 के रोगजनन में LRRK2 के लिए एक भूमिका के लिए आनुवंशिक सबूत बताते हैं.
<pवर्ग = "jove_content"> प्रोटीन की phosphorylation कोशिकाओं में एक आम नियामक तंत्र है. उदाहरण के लिए, phosphorylation एंजाइमों के क्रियान्वयन के लिए या एक संकेतन जटिल करने के लिए प्रोटीन की भर्ती के लिए आवश्यक हो सकता है. LRRK2 के सेलुलर phosphorylation बड़े पैमाने पर होती है और phosphosite मानचित्रण ankyrin दोहराने और leucine संपन्न दोहराने डोमेन 9-11 के बीच एक क्लस्टर में होने के सेलुलर phosphorylation साइटों के बहुमत से पता चला है. LRRK1 सेलुलर phosphorylation साइटों मैप किया जा करने के लिए अभी तक हालांकि, Cos7 कोशिकाओं से immunoprecipitated LRRK1 प्रोटीन की blots की phosphoprotein धुंधला का उपयोग अध्ययन से सबूत LRRK1 प्रोटीन कोशिकाओं 12 में phosphorylated है कि पता चलता है.इस पत्र 32 पी orthophosphate साथ चयापचय लेबलिंग का उपयोग सेल लाइनों में LRRK1 और LRRK2 के सामान्य phosphorylation स्तर परख करने की क्रिया के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल प्रदान करता है. समग्र रणनीति सरल है. आत्मीयता LRRK prote में चिह्नितआईएनएस 32 पी orthophosphate युक्त मध्यम के संपर्क में हैं जो HEK293T कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं. 32 पी orthophosphate केवल कुछ ऊष्मायन के घंटे और फॉस्फेट युक्त कक्ष में सभी अणुओं के बाद कोशिकाओं से ग्रहण कर लेता है, जिससे radioactively लेबल रहे हैं. आत्मीयता टैग (3xflag) तो immunoprecipitation द्वारा अन्य सेलुलर घटकों से LRRK प्रोटीन को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है. Immunoprecipitates तो एसडीएस पृष्ठ के माध्यम से अलग हो रहे हैं, PVDF झिल्ली और शामिल फॉस्फेट का विश्लेषण करने के लिए मिट blots पर प्रोटीन की autoradiography (32 पी संकेत) और पश्चिमी पहचान (प्रोटीन संकेत) द्वारा किया जाता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पत्र 32 पी orthophosphate साथ चयापचय लेबलिंग का उपयोग सेल लाइनों में LRRK1 और LRRK2 के सामान्य phosphorylation स्तर परख करने की क्रिया के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल प्रदान करता है. समग्र रणनीति सरल है. आत्मीयता LRRK प्रोटीन 32<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम भी इस अध्ययन का समर्थन माइकल जे फॉक्स फाउंडेशन के लिए आभारी हैं. फ़्लैंडर्स FWO (FWO परियोजना G.0666.09, जेएमटी को वरिष्ठ शोधकर्ता फैलोशिप), आईडब्ल्यूटी SBO/80020 परियोजना न्यूरो लक्ष्य, यू लोवेन (OT/08/052A और IOF-KP/07 / 001) – हम रिसर्च फाउंडेशन को धन्यवाद उनके समर्थन के लिए. इस शोध भी जेएमटी को राजा Baudouin फाउंडेशन द्वारा प्रबंधित फंड Druwé-Eerdekens द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11971-025 | This medium contains no phosphates |
| Anti Flag M2 affiinty gel | Sigma | A2220 | For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426. |
| Extra thick blotting filter | Bio-Rad | 1703965 | |
| Ponceau S solution | Sigma | P7170 |
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