Metabolsk Merking av leucine Rich Gjenta Kinaser en og to med Radioaktiv Fosfat
Summary
Leucin-rik vend kinaser 1 og 2 (LRRK1 og LRRK2) er multidomain proteiner som koder både GTPase-og kinase-domener og som er fosforylert i celler. Her presenterer vi en protokoll for å merke LRRK1 og LRRK2 i celler med 32 P orthophosphate, og gir dermed et middel til å måle sine samlede mobil phophorylation nivåer.
Abstract
Leucin-rik vend kinaser 1 og 2 (LRRK1 og LRRK2) er paralogs som deler et lignende domene organisasjon, inkludert en serin-treonin-kinase-domene, et Ras av komplekse proteiner domene (ROC), et C-terminalt domene av ROC (COR), og leucin-rik og Ankyrin-lignende gjentagelser ved N-terminus. De nøyaktige cellulære roller LRRK1 og LRRK2 er ennå ikke klarlagt, men LRRK1 har vært innblandet i tyrosinkinasereseptor signale 1,2, mens LRRK2 er implisert i patogenesen av Parkinsons sykdom 3,4. I denne rapporten presenterer vi en protokoll for å merke LRRK1 og LRRK2 proteiner i celler med 32 P orthophosphate, og gir dermed et middel til å måle den samlede fosforylering nivåer av disse to proteiner i celler. I korte trekk, affinitet tagget LRRK proteiner er uttrykt i HEK293T celler som utsettes for medium som inneholder 32 P-orthophosphate. Den 32 P-orthophosphate er assimilert av cellene etter bare et fåtalltimers inkubering og alle molekyler i cellen inneholdende fosfater blir derved radioaktivt merket. Via den affinitet tag (3xflag) de LRRK proteiner er isolert fra andre cellulære komponenter av immunoprecipitation. Immunoutfellinger blir deretter separert via SDS-PAGE, blottet på PVDF-membraner og analyse av de inkorporerte fosfater utføres ved autoradiografi (32 P-signal) og western deteksjon (protein-signal) av proteinene på blots. Protokollen kan lett tilpasses for å overvåke fosforylering av ethvert annet protein som kan uttrykkes i celler, og isoleres ved immunoutfelling.
Introduction
Leucine rikt gjenta kinaser 1 og 2 (LRRK1 og LRRK2) er multidomain paralogs som deler en lignende domene organisasjon. Begge proteiner koder en GTPase-sekvens beslektet med Ras familien GTPases (RAS av komplekse proteiner, eller ROC) så vel som et C-terminalt domene av ROC (COR), en effektiv måte å klassifisere begge proteiner til ROCO protein familien 5,6. N-terminalen av ROC-COR domene tandem, begge proteiner koder en leucin-rik vendende domene, samt en Ankyrin-lignende domene, mens bare LRRK2 koder for et ekstra armadillo domein 6-8. C-terminal av ROC-COR, både proteiner dele en serin-treonin kinase domenet mens bare LRRK2 koder for et WD40 domene i C-terminal region 8. De nøyaktige cellulære roller LRRK1 og LRRK2 er ennå ikke klarlagt, men LRRK1 har vært innblandet i tyrosinkinasereseptor signale 1,2, mens genetisk bevis peker mot en rolle for LRRK2 i patogenesen av Parkinsons sykdom 3,4.
<pclass = "jove_content"> Fosforyleringen av proteiner er en vanlig reguleringsmekanisme i celler. For eksempel kan fosforylering være essensielle for aktiveringen av enzymer eller ved rekruttering av proteiner til et signalkompleks. Den cellulære fosforylering av LRRK2 har blitt grundig beskrevet og phosphosite kartlegging har vist et flertall av mobilnettet fosforylering sider for å oppstå i en klynge mellom Ankyrin gjenta og leucine rike gjenta domener 9-11. Selv LRRK1 cellular fosforylering nettsteder har ennå ikke kartlagt, bevis fra studier med fosfoprotein farging av blotter av immunoutfelt LRRK1 protein fra COS7 celler tyder på at LRRK1 protein er fosforylert i celler 12.Denne artikkelen gir en grunnleggende protokollen for å analysere generelle fosforylering nivå LRRK1 og LRRK2 i cellelinjer ved hjelp av metabolsk merking med 32 P-orthophosphate. Den overordnede strategi er enkel. Affinity tagget LRRK proteins er uttrykt i HEK293T celler som utsettes for medium som inneholder 32 P-orthophosphate. Den 32 P-ortofosfat er assimilert av cellene etter bare noen få timer med inkubering, og alle molekyler i cellen inneholdende fosfater blir derved radioaktivt merket. Affiniteten tag (3xflag) blir så brukt til å isolere de LRRK proteiner fra andre cellulære komponenter ved immunoutfelling. Immunoutfellinger blir deretter separert via SDS-PAGE, blottet på PVDF-membraner og analyse av de inkorporerte fosfater utføres ved autoradiografi (32 P-signal) og western deteksjon (protein-signal) av proteinene på blots.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikkelen gir en grunnleggende protokollen for å analysere generelle fosforylering nivå LRRK1 og LRRK2 i cellelinjer ved hjelp av metabolsk merking med 32 P-orthophosphate. Den overordnede strategi er enkel. Affinity tagget LRRK proteiner er uttrykt i HEK293T celler som er eksponert for medium inneholdende 32 P-ortofosfat. Den 32 P-ortofosfat er assimilert av cellene etter bare noen få timer med inkubering, og alle molekyler i cellen inneholdende fosfater blir derved radioaktiv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er også takknemlig til Michael J. Fox Foundation støtter denne studien. Vi takker Research Foundation – Flandern FWO (FWO prosjektet G.0666.09, senior forsker fellesskapet til JMT), den IWT SBO/80020 prosjektet Neuro-TARGET, KU Leuven (OT/08/052A og IOF-KP/07 / 001) for deres støtte. Denne forskningen ble også støttet delvis av fondet Druwé-EERDEKENS forvaltes av Kong Baudouin Foundation til JMT.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11971-025 | This medium contains no phosphates |
| Anti Flag M2 affiinty gel | Sigma | A2220 | For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426. |
| Extra thick blotting filter | Bio-Rad | 1703965 | |
| Ponceau S solution | Sigma | P7170 |
References
- Hanafusa, H. Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor. Nat Commun. 2, 158 (2011).
- Titz, B., et al. The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization. Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).
- Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson’s disease. Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).
- Taymans, J. M., Cookson, M. Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau. Bioessays. 32, 227-235 (2010).
- Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol Cell. 101, 183-191 (2009).
- Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. The Roco protein family: a functional perspective. FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).
- Marin, I. The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights. Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).
- Marin, I. Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2. J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).
- Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate. Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).
- Gloeckner, C. J., et al. Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2. J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).
- Nichols, R. J., et al. 14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson’s disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization. Biochem J. 430, 393-404 (2010).
- Greggio, E., et al. Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1. J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).
- Taymans, J. M. LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding. PLoS One. 6, 23207-23 (2011).
- Daniëls, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. J Neurochem. 116, 304-315 (2011).
- Civiero, L. Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers. PLoS One. 7, e43472 (2012).
- Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain. J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).
- Lewis, P. A. Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro. J Vis Exp. , (2012).
- Lobbestael, E. Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags. BMC Biotechnol. 10, 16 (2010).
- Davies, P., et al. Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies. Biochem J. , (2013).
- West, A. B. Parkinson’s disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity. Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).
- Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Sci Transl Med. 4, 164ra161 (2012).
- Li, X., et al. Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson’s disease. PLoS One. 6, e17153 (2011).
- Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).
