Trasplante De InducidaS Pluripotentes Derivadas De Células Madre Mesoangioblastos Como Progenitores Miógenos En Modelos De Ratón De La Regeneración Muscular

Summary

Células madre pluripotentes inducidas (iPSC)-progenitores miógenos derivados son candidatos prometedores para las estrategias de terapia celular para tratar las distrofias musculares. Este protocolo describe el trasplante y las medidas funcionales necesarias para evaluar el injerto y la diferenciación de mesoangioblastos derivados de iPSC (un tipo de progenitores musculares) en modelos de ratón de regeneración muscular aguda y crónica.

Abstract

los iPSCs Paciente-derivados podían ser una fuente inestimable de células para los protocolos autólogos futuros de la terapia celular. Las células madre/progenitoras miógenas derivadas de iPSC similares a los mesoangioblastos derivados del pericito (células madre/progenitoras similares a mesoangioblastos derivadas de iPSC: IDEMs) se pueden establecer a partir de iPSCs generadas a partir de pacientes afectados por diferentes formas de distrofia muscular. Los IDEM específicos del paciente pueden corregirse genéticamente con diferentes estrategias(por ejemplo, vectores lentivirales, cromosomas artificiales humanos) y mejorarse en su potencial de diferenciación miogénica tras la sobreexpresión del regulador de la miogénesis MyoD. Este potencial miógeno se evalúa in vitro con ensayos específicos de diferenciación y se analiza por inmunofluorescencia. El potencial regenerativo de IDEMs se evalúa más a fondo in vivo,sobre el trasplante intramuscular e intrarterial en dos modelos representativos del ratón que exhiben la regeneración aguda y crónica del músculo. La contribución de idems al músculo esquelético del anfitrión entonces es confirmada por diversas pruebas funcionales en ratones trasplantados. En particular, el mejoramiento de la capacidad motora de los animales se estudia con pruebas en cinta de correr. El engraftment y la diferenciación de la célula entonces son evaluados por un número de análisis histológicos y de la inmunofluorescencia en los músculos trasplantados. En general, este trabajo describe los ensayos y herramientas utilizados actualmente para evaluar la capacidad de diferenciación de los IDEMs, centrándose en los métodos de trasplante y las medidas de resultado posteriores para analizar la eficacia del trasplante de células.

Introduction

Los mesoangioblastos (MABs) son progenitores musculares asociados a vasos derivados de un subconjunto de pericitos^1-3. La principal ventaja de los MABs sobre los progenitores musculares canónicos, como las células satélite^4, reside en su capacidad para cruzar la pared del vaso cuando se entregan intraarteriales y, por lo tanto, contribuir a la regeneración del músculo esquelético en los protocolos de terapia celular. Esta característica ha sido evaluada y confirmada tanto en modelos murinos como caninos de distrofia muscular^1,5,6. Estos estudios preclínicos han sentado las bases para un primer ensayo clínico de fase I/II basado en el trasplante intraarterial de MABs HLA-idénticos al donante en niños con distrofia muscular de Duchenne (EudraCT no. 2011-000176-33; actualmente en curso en el Hospital San Raffaele de Milán, Italia). Uno de los principales obstáculos de los enfoques de terapia celular, en los que se necesitan miles de millones de células para tratar el músculo de todo un cuerpo, es el limitado potencial proliferativo del “medicamento” (las células). Por otra parte se ha demostrado recientemente que no es posible obtener MABs de pacientes afectados por algunas formas de distrofias musculares, pues ocurre en la distrofia muscular 2D de la miembro-faja (LGMD2D; OMIM #608099)⁷.

Para superar estas limitaciones, recientemente se ha establecido un protocolo para derivar células madre/progenitoras similares al MAB a partir de iPSCs humanas y murinas^7. Este procedimiento genera poblaciones celulares fácilmente expandibles con una firma de genes vasculares e inmunofenotipos altamente similares a los MABs derivados del músculo adulto. Tras la expresión del factor regulador miogénico MyoD, tanto murino como humano IDEMs (respectivamente MIDEMs y HIDEMs) experimentan diferenciación terminal del músculo esquelético. Para lograr este objetivo, los IDEMs pueden ser transducidos con vectores capaces de impulsar la expresión de MyoD, ya sea de forma constitutiva o inducible^8-10. Se utiliza un vector lentiviral que contiene AdNc MyoD fusionado con el receptor de estrógeno (MyoD-ER), lo que permite su translocación nuclear tras la administración de tamoxifeno (un análogo del estrógeno)^11. Esta estrategia resulta en la formación de miotubos multinucleados hipertróficos, con alta eficiencia^7. En particular, los IDEM son notumorigenic, pueden engraft y diferenciar dentro de los músculos del anfitrión sobre el trasplante y se pueden corregir genético usando diversos vectores(e.g. lentiviruses o cromosomas artificiales humanos), allanando el camino para las estrategias terapéuticas autólogas futuras. La derivación, caracterización y trasplante de IDEMs han sido descritos en la publicación anterior⁷. Este papel del protocolo detalla los análisis realizados para evaluar la diferenciación miógena in vitro de IDEMs y las medidas subsecuentes del resultado para probar la eficacia de su trasplante en los modelos del ratón de la regeneración del músculo.

Protocol

1. Evaluación del potencial miogénico y de injerto In vitro: Diferenciación inducida por MyoD Generar una línea celular estable de IDEMs transducidos con el vector lentiviral Tamoxifeno-inducible MyoD-ER, titulando la multiplicidad de infección (MOI; por ejemplo, 1, 5 y 50) utilizando la tinción descrita en 1.1.9 (MyHC) como resultado de la eficiencia del procedimiento. Recubrir un plato de 3,5 cm con 1 ml de Matrigel al 1% e incubar durante 30 min a 37 °C. <l…

Representative Results

Los resultados representativos reportados siguen los principales ensayos in vitro/in vivo representados en el flujo de trabajo en la Figura 1. 48 horas después de la administración de 4OH-tamoxifeno Los núcleos MyoD-positivos son identificables dentro de los IDEMs transducidos por MyoD-ER en cultivo(Figura 2A). A continuación, las células se fusionan y se diferencian en miotubos multinucleados(Figura 2B). Cuando se trasplantan por vía intramuscular a un mo…

Discussion

Los iPSC pueden ampliarse indefinidamente preservando su potencial de auto-renovación y, por lo tanto, ser dirigidos a diferenciarse en una amplia gama de linajes celulares¹². Por esta y otras razones, las células madre/progenitoras derivadas de iPSC se consideran una fuente prometedora para los enfoques autólogos de terapia génica y celular¹³. Un trabajo publicado previamente de los autores informó de la generación de progenitores miógenos de ratón y humanos a partir de iPSCs con un fenotip…

Materials

			REAGENTS
MegaCell DMEM	Sigma	M3942
DMEM	Sigma	D5671
IMDM	Sigma	I3390
Horse serum	Euroclone	ECS0090L
Foetal Bovine Serum	Lonza	DE14801F
PBS Calcium/Magnesium free	Lonza	BE17-516F
L-Glutammine	Sigma	G7513
Penicilline/Streptomicin	Sigma	P0781
2-Mercaptoethanol	Gibco	31350-010
ITS (Insulin-Transferrin-Selenium)	Gibco	51500-056
Non-essential amino acid solution	Sigma	M7145
Fer-In-Sol	Mead Johnson
Ferlixit	Aventis
Oleic Acid	Sigma	01257-10 mg
Linoleic Acid	Sigma	L5900-10 mg
Human bFGF	Gibco	AA 10-155
Grow factors-reduced Matrigel	Becton Dickinson	356230
Trypsin	Sigma	T3924
Sodium heparin	Mayne Pharma
Trypan blue solution	Sigma	T8154	HARMFUL
Patent blue dye	Sigma	19, 821-8
EDTA	Sigma	E-4884
Paraformaldehyde	TAAB	P001	HARMFUL
Tamoxifen	Sigma	T5648
4-OH Tamoxifen	Sigma	H7904
pLv-CMV-MyoD-ER(T)	Addgene	26809
Cardiotoxin	Sigma	C9759	HARMFUL
Povidone iodine
Tragachant gum	MP biomedicals	104792
Isopenthane	VWR	24,872,323
Tissue-tek OCT	Sakura	4583
Sucrose	VWR	27,480,294
Polarized glass slides	Thermo	J1800AMNZ
Eosin Y	Sigma	E4382
Hematoxylin	Sigma	HHS32
Masson's trichrome	Bio-Optica	04-010802
Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody	DSHB	MF20
Mouse anti Lamin A/C antibody	Novocastra	NLC-LAM-A/C
4/11/13	Cappel	559762
Hoechst 33342	Sigma fluka	B2261
Rabbit anti Laminin antibody	Sigma	L9393
			MATERIALS AND EQUIPMENT
Adsorbable antibacteric suture 4-0	Ethicon	vcp310h
30G needle syringe	BD	324826
Treadmill	Columbus instrument
Steromicroscope	Nikon	SMZ800
Inverted microscope	Leica	DMIL LED
Isoflurane unit	Harvad Apparatus
Fiber optics	Euromecs (Holland)	EK1
Heating pad	Vet Tech	C17A1
Scalpels	Swann-Morton	11REF050
Surgical forceps	Fine Scientific Tools		5/45
High temperature cauteriser	Bovie Medical	AA01
			MEDIA COMPOSITION
			Media composition is detailed below. HIDEMs growth medium: MegaCell Dulbecco's Modified Eagle Medium (MegaCell DMEM) 5% fetal bovine serum (FBS) 2 mM glutamine 0.1 mM β-mercaptoethanol 1% non essential amino acids 5 ng / ml human basic fibroblast growth factor (bFGF) 100 IU ml penicillin 100 mg / ml streptomycin Alternatively, if some of the above reagents are not available, HIDEMs can be grown in: Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) 10 % FBS 2 mM glutamine 0.1 mM β-mercaptoethanol 1% Non essential amino acids (NEAA) 1% ITS (insulin / transferrin / selenium) 5 ng / ml human bFGF 100 IU ml penicillin 100 mg / ml streptomycin 0.5 μM oleic and linoleic acids 1.5 μM Fe2+ (Fer-In-Sol) 0.12 μM Fe3+ (Ferlixit) MIDEMs growth medium: DMEM 20 % FBS 2 mM glutamine 5 ng / ml human bFGF 100 IU ml penicillin 100 mg / ml streptomycin Differentiation medium: DMEM 2 % Horse Serum (HS) 100 IU ml penicillin 100 mg / ml streptomycin 2 mM glutamine

Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media.