Transplantation av inducerad Pluripotent Stamcell-härledd Mesoangioblast-liknande Myogena föregångare i musmodeller av muskelregenerering

Summary

Inducerad pluripotent stamcell (iPSC)-härledda myogena stamceller är lovande kandidater för cellterapi strategier för att behandla muskulösa dystrophies. Detta protokoll beskriver transplantation och funktionella mätningar som krävs för att utvärdera engraftment och differentiering av iPSC-härledda mesoangioblaster (en typ av muskel avkomma) i mus modeller av akut och kronisk muskel regenerering.

Abstract

Patient-härledda iPSCs kan vara en ovärderlig källa till celler för framtida autolog cell terapi protokoll. iPSC-härledda myogena stam/stamceller som liknar pericyte-härledda mesoangioblaster (iPSC-härledda mesoangioblastliknande stam-/stamceller: IDEM) kan fastställas från iPSCs som genereras från patienter som drabbats av olika former av muskeldystrofi. Patientspecifika IDEMs kan korrigeras genetiskt med olika strategier(t.ex. lentivirala vektorer, mänskliga konstgjorda kromosomer) och förbättras i deras myogena differentiering potential vid överuttryck av myogenes regulator MyoD. Denna myogena potential utvärderas sedan in vitro med specifika differentieringsanalyser och analyseras av immunofluorescens. Den regenerativa potentialen hos IDEMs utvärderas ytterligare in vivo, vid intramuskulär och intra-arteriell transplantation i två representativa musmodeller som visar akut och kronisk muskelregenerering. IDEMs bidrag till värd skelettmuskeln bekräftas sedan av olika funktionella tester hos transplanterade möss. I synnerhet studeras förbättringen av djurens motoriska kapacitet med löpbandstester. Cellengraftment och differentiering bedöms sedan av ett antal histologiska och immunofluorescens analyser på transplanterade muskler. Sammantaget beskriver detta dokument de analyser och verktyg som för närvarande används för att utvärdera differentieringskapaciteten hos IDEMs, med fokus på transplantationsmetoder och efterföljande utfallsåtgärder för att analysera effekten av celltransplantation.

Introduction

Mesoangioblaster (MAB) är kärlrelaterade muskelavkompitorer som härrör från en delmängd av pericyter^1-3. Den största fördelen med MABs över kanoniska muskel stamceller såsom satellitceller⁴ ligger i deras förmåga att korsa kärlväggen när de levereras intra-kranskärlen och därmed bidra till skelettmuskulatur regenerering i cellterapi protokoll. Denna funktion har utvärderats och bekräftats i både murin- och hundmodeller av muskeldystrofi^1,5,6. Dessa prekliniska studier har byggt grunden för en första-i-man fas I/II klinisk studie baserad på intraartärtransplantation av donator HLA-identiska MABs hos barn med Duchenne muskeldystrofi (EudraCT nr 2011-000176-33; för närvarande pågår på San Raffaele sjukhus i Milano, Italien). Ett av de största hindren för cellterapimetoder, där miljarder celler behövs för att behandla muskeln i en hel kropp, är den begränsade proliferativa potentialen hos “läkemedlet” (cellerna). Dessutom har det nyligen visats att det inte är möjligt att få MAB från patienter som drabbats av vissa former av muskeldystroféer, eftersom det förekommer i muskeldystrofi 2D (LGMD2D; OMIM #608099)⁷.

För att övervinna dessa begränsningar har ett protokoll för härledande MAB-liknande stam-/stamceller från mänskliga och murin iPSCs nyligen upprättats⁷. Detta förfarande genererar lätt expanderbara cellpopulationer med en vaskulär gen signatur och immunophenotype mycket liknar vuxna muskel-härledda MABs. Vid uttryck av myogena reglerande faktorn MyoD genomgår både murin och mänskliga IDEMs (respektive MIDEMs och HIDEMs) terminal skelettmuskel differentiering. För att uppnå detta mål kan IDEMs transducera med vektorer som kan driva MyoD-uttryck, antingen konstitutivt eller på ett inducible sätt^8-10. En lentiviral vektor som innehåller MyoD cDNA smält med östrogenreceptorn (MyoD-ER) används, vilket möjliggör dess nukleära flyttning vid tamoxifen (en östrogenanalog)^{administrering 11}. Denna strategi resulterar i bildandet av hypertrofisk multinukleära myotuber, med hög effektivitet⁷. IDEMs är särskilt icke-tumorigena, kan inskriva och differentiera inuti värdmuskler vid transplantation och kan korrigeras genetiskt med olika vektorer(t.ex. lentivirus eller mänskliga konstgjorda kromosomer), vilket banar väg för framtida autologa terapeutiska strategier. Härledning, karakterisering och transplantation av IDEMs har beskrivits i ovanstående publikation⁷. Detta protokollpapper beskriver de analyser som utförts för att utvärdera in vitro myogen differentiering av IDEMs och efterföljande resultat mätningar för att testa effekten av deras transplantation i mus modeller av muskel regenerering.

Protocol

1. Bedömning av myogen och engraftmentpotential In vitro:MyoD-inducerad differentiering Generera en stabil cellinje av IDEMs transduced med tamoxifen-inducerbara MyoD-ER lentiviral vektor, titrerar multiplicity av infektion (MOI; t.ex. 1, 5 och 50) med hjälp av den färgning som beskrivs i 1.1.9 (MyHC) som ett resultat av förfarandets effektivitet. Täck en 3,5 cm skål med 1 ml 1% Matrigel och inkubera i 30 min vid 37 °C. Tvätta plattan två gånger med med…

Representative Results

De rapporterade representativa resultaten följer de viktigaste in vitro/in vivo-analyserna som beskrivs i arbetsflödet i figur 1. 48 timmar efter administrering av myoD-positiva kärnor efter administrering av 4OH-tamoxifen är identifierbara inom MyoD-ER-transduced IDEMs in culture(figur 2A). Cellerna smälter sedan samman och differentierar sig till flerkärniga myotuber (Figur 2B). När IDEMs transplanteras intramuskulärt till en murinmodell av akut muskel…

Discussion

iPSCs kan utökas på obestämd tid samtidigt som deras självförnyelsepotential bevaras och därmed hänvisas till att differentiera till ett brett spektrum av cellinje¹². Av denna och andra skäl anses iPSC-härledda stam/stamceller vara en lovande källa för autolog gen- och cellterapimetoder¹³. Ett tidigare publicerat verk från författarna rapporterade genereringen av mus och mänskliga myogena stamceller från iPSCs med en fenotyp som liknar pericyte-härledda MABs (IDEMs) och deras effekti…

Materials

			REAGENTS
MegaCell DMEM	Sigma	M3942
DMEM	Sigma	D5671
IMDM	Sigma	I3390
Horse serum	Euroclone	ECS0090L
Foetal Bovine Serum	Lonza	DE14801F
PBS Calcium/Magnesium free	Lonza	BE17-516F
L-Glutammine	Sigma	G7513
Penicilline/Streptomicin	Sigma	P0781
2-Mercaptoethanol	Gibco	31350-010
ITS (Insulin-Transferrin-Selenium)	Gibco	51500-056
Non-essential amino acid solution	Sigma	M7145
Fer-In-Sol	Mead Johnson
Ferlixit	Aventis
Oleic Acid	Sigma	01257-10 mg
Linoleic Acid	Sigma	L5900-10 mg
Human bFGF	Gibco	AA 10-155
Grow factors-reduced Matrigel	Becton Dickinson	356230
Trypsin	Sigma	T3924
Sodium heparin	Mayne Pharma
Trypan blue solution	Sigma	T8154	HARMFUL
Patent blue dye	Sigma	19, 821-8
EDTA	Sigma	E-4884
Paraformaldehyde	TAAB	P001	HARMFUL
Tamoxifen	Sigma	T5648
4-OH Tamoxifen	Sigma	H7904
pLv-CMV-MyoD-ER(T)	Addgene	26809
Cardiotoxin	Sigma	C9759	HARMFUL
Povidone iodine
Tragachant gum	MP biomedicals	104792
Isopenthane	VWR	24,872,323
Tissue-tek OCT	Sakura	4583
Sucrose	VWR	27,480,294
Polarized glass slides	Thermo	J1800AMNZ
Eosin Y	Sigma	E4382
Hematoxylin	Sigma	HHS32
Masson's trichrome	Bio-Optica	04-010802
Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody	DSHB	MF20
Mouse anti Lamin A/C antibody	Novocastra	NLC-LAM-A/C
4/11/13	Cappel	559762
Hoechst 33342	Sigma fluka	B2261
Rabbit anti Laminin antibody	Sigma	L9393
			MATERIALS AND EQUIPMENT
Adsorbable antibacteric suture 4-0	Ethicon	vcp310h
30G needle syringe	BD	324826
Treadmill	Columbus instrument
Steromicroscope	Nikon	SMZ800
Inverted microscope	Leica	DMIL LED
Isoflurane unit	Harvad Apparatus
Fiber optics	Euromecs (Holland)	EK1
Heating pad	Vet Tech	C17A1
Scalpels	Swann-Morton	11REF050
Surgical forceps	Fine Scientific Tools		5/45
High temperature cauteriser	Bovie Medical	AA01
			MEDIA COMPOSITION
			Media composition is detailed below. HIDEMs growth medium: MegaCell Dulbecco's Modified Eagle Medium (MegaCell DMEM) 5% fetal bovine serum (FBS) 2 mM glutamine 0.1 mM β-mercaptoethanol 1% non essential amino acids 5 ng / ml human basic fibroblast growth factor (bFGF) 100 IU ml penicillin 100 mg / ml streptomycin Alternatively, if some of the above reagents are not available, HIDEMs can be grown in: Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) 10 % FBS 2 mM glutamine 0.1 mM β-mercaptoethanol 1% Non essential amino acids (NEAA) 1% ITS (insulin / transferrin / selenium) 5 ng / ml human bFGF 100 IU ml penicillin 100 mg / ml streptomycin 0.5 μM oleic and linoleic acids 1.5 μM Fe2+ (Fer-In-Sol) 0.12 μM Fe3+ (Ferlixit) MIDEMs growth medium: DMEM 20 % FBS 2 mM glutamine 5 ng / ml human bFGF 100 IU ml penicillin 100 mg / ml streptomycin Differentiation medium: DMEM 2 % Horse Serum (HS) 100 IU ml penicillin 100 mg / ml streptomycin 2 mM glutamine

Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media.