Inducerad pluripotent stamcell (iPSC)-härledda myogena stamceller är lovande kandidater för cellterapi strategier för att behandla muskulösa dystrophies. Detta protokoll beskriver transplantation och funktionella mätningar som krävs för att utvärdera engraftment och differentiering av iPSC-härledda mesoangioblaster (en typ av muskel avkomma) i mus modeller av akut och kronisk muskel regenerering.
Patient-härledda iPSCs kan vara en ovärderlig källa till celler för framtida autolog cell terapi protokoll. iPSC-härledda myogena stam/stamceller som liknar pericyte-härledda mesoangioblaster (iPSC-härledda mesoangioblastliknande stam-/stamceller: IDEM) kan fastställas från iPSCs som genereras från patienter som drabbats av olika former av muskeldystrofi. Patientspecifika IDEMs kan korrigeras genetiskt med olika strategier(t.ex. lentivirala vektorer, mänskliga konstgjorda kromosomer) och förbättras i deras myogena differentiering potential vid överuttryck av myogenes regulator MyoD. Denna myogena potential utvärderas sedan in vitro med specifika differentieringsanalyser och analyseras av immunofluorescens. Den regenerativa potentialen hos IDEMs utvärderas ytterligare in vivo, vid intramuskulär och intra-arteriell transplantation i två representativa musmodeller som visar akut och kronisk muskelregenerering. IDEMs bidrag till värd skelettmuskeln bekräftas sedan av olika funktionella tester hos transplanterade möss. I synnerhet studeras förbättringen av djurens motoriska kapacitet med löpbandstester. Cellengraftment och differentiering bedöms sedan av ett antal histologiska och immunofluorescens analyser på transplanterade muskler. Sammantaget beskriver detta dokument de analyser och verktyg som för närvarande används för att utvärdera differentieringskapaciteten hos IDEMs, med fokus på transplantationsmetoder och efterföljande utfallsåtgärder för att analysera effekten av celltransplantation.
Mesoangioblaster (MAB) är kärlrelaterade muskelavkompitorer som härrör från en delmängd av pericyter1-3. Den största fördelen med MABs över kanoniska muskel stamceller såsom satellitceller4 ligger i deras förmåga att korsa kärlväggen när de levereras intra-kranskärlen och därmed bidra till skelettmuskulatur regenerering i cellterapi protokoll. Denna funktion har utvärderats och bekräftats i både murin- och hundmodeller av muskeldystrofi1,5,6. Dessa prekliniska studier har byggt grunden för en första-i-man fas I/II klinisk studie baserad på intraartärtransplantation av donator HLA-identiska MABs hos barn med Duchenne muskeldystrofi (EudraCT nr 2011-000176-33; för närvarande pågår på San Raffaele sjukhus i Milano, Italien). Ett av de största hindren för cellterapimetoder, där miljarder celler behövs för att behandla muskeln i en hel kropp, är den begränsade proliferativa potentialen hos “läkemedlet” (cellerna). Dessutom har det nyligen visats att det inte är möjligt att få MAB från patienter som drabbats av vissa former av muskeldystroféer, eftersom det förekommer i muskeldystrofi 2D (LGMD2D; OMIM #608099)7.
För att övervinna dessa begränsningar har ett protokoll för härledande MAB-liknande stam-/stamceller från mänskliga och murin iPSCs nyligen upprättats7. Detta förfarande genererar lätt expanderbara cellpopulationer med en vaskulär gen signatur och immunophenotype mycket liknar vuxna muskel-härledda MABs. Vid uttryck av myogena reglerande faktorn MyoD genomgår både murin och mänskliga IDEMs (respektive MIDEMs och HIDEMs) terminal skelettmuskel differentiering. För att uppnå detta mål kan IDEMs transducera med vektorer som kan driva MyoD-uttryck, antingen konstitutivt eller på ett inducible sätt8-10. En lentiviral vektor som innehåller MyoD cDNA smält med östrogenreceptorn (MyoD-ER) används, vilket möjliggör dess nukleära flyttning vid tamoxifen (en östrogenanalog)administrering 11. Denna strategi resulterar i bildandet av hypertrofisk multinukleära myotuber, med hög effektivitet7. IDEMs är särskilt icke-tumorigena, kan inskriva och differentiera inuti värdmuskler vid transplantation och kan korrigeras genetiskt med olika vektorer(t.ex. lentivirus eller mänskliga konstgjorda kromosomer), vilket banar väg för framtida autologa terapeutiska strategier. Härledning, karakterisering och transplantation av IDEMs har beskrivits i ovanstående publikation7. Detta protokollpapper beskriver de analyser som utförts för att utvärdera in vitro myogen differentiering av IDEMs och efterföljande resultat mätningar för att testa effekten av deras transplantation i mus modeller av muskel regenerering.
iPSCs kan utökas på obestämd tid samtidigt som deras självförnyelsepotential bevaras och därmed hänvisas till att differentiera till ett brett spektrum av cellinje12. Av denna och andra skäl anses iPSC-härledda stam/stamceller vara en lovande källa för autolog gen- och cellterapimetoder13. Ett tidigare publicerat verk från författarna rapporterade genereringen av mus och mänskliga myogena stamceller från iPSCs med en fenotyp som liknar pericyte-härledda MABs (IDEMs) och deras effekti…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Giulio Cossu, Martina Ragazzi och hela laboratoriet för hjälpsam diskussion och stöd, och Jeff Chamberlain för vänligt tillhandahållaNde MyoD-ER vektor. Alla försök med levande djur slutfördes i enlighet med och i enlighet med alla relevanta reglerings- och institutionella organ, förordningar och riktlinjer. Arbetet i författarnas laboratorium stöds av UK Medical Research Council, Europeiska gemenskapens sjunde ramprojekt Optistem and Biodesign och det italienska duchenne parent project.
REAGENTS | |||
MegaCell DMEM | Sigma | M3942 | |
DMEM | Sigma | D5671 | |
IMDM | Sigma | I3390 | |
Horse serum | Euroclone | ECS0090L | |
Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14801F | |
PBS Calcium/Magnesium free | Lonza | BE17-516F | |
L-Glutammine | Sigma | G7513 | |
Penicilline/Streptomicin | Sigma | P0781 | |
2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
ITS (Insulin-Transferrin-Selenium) | Gibco | 51500-056 | |
Non-essential amino acid solution | Sigma | M7145 | |
Fer-In-Sol | Mead Johnson | ||
Ferlixit | Aventis | ||
Oleic Acid | Sigma | 01257-10 mg | |
Linoleic Acid | Sigma | L5900-10 mg | |
Human bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
Grow factors-reduced Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | |
Trypsin | Sigma | T3924 | |
Sodium heparin | Mayne Pharma | ||
Trypan blue solution | Sigma | T8154 | HARMFUL |
Patent blue dye | Sigma | 19, 821-8 | |
EDTA | Sigma | E-4884 | |
Paraformaldehyde | TAAB | P001 | HARMFUL |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
4-OH Tamoxifen | Sigma | H7904 | |
pLv-CMV-MyoD-ER(T) | Addgene | 26809 | |
Cardiotoxin | Sigma | C9759 | HARMFUL |
Povidone iodine | |||
Tragachant gum | MP biomedicals | 104792 | |
Isopenthane | VWR | 24,872,323 | |
Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | |
Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
Polarized glass slides | Thermo | J1800AMNZ | |
Eosin Y | Sigma | E4382 | |
Hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
Masson's trichrome | Bio-Optica | 04-010802 | |
Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF20 | |
Mouse anti Lamin A/C antibody | Novocastra | NLC-LAM-A/C | |
4/11/13 | Cappel | 559762 | |
Hoechst 33342 | Sigma fluka | B2261 | |
Rabbit anti Laminin antibody | Sigma | L9393 | |
MATERIALS AND EQUIPMENT | |||
Adsorbable antibacteric suture 4-0 | Ethicon | vcp310h | |
30G needle syringe | BD | 324826 | |
Treadmill | Columbus instrument | ||
Steromicroscope | Nikon | SMZ800 | |
Inverted microscope | Leica | DMIL LED | |
Isoflurane unit | Harvad Apparatus | ||
Fiber optics | Euromecs (Holland) | EK1 | |
Heating pad | Vet Tech | C17A1 | |
Scalpels | Swann-Morton | 11REF050 | |
Surgical forceps | Fine Scientific Tools | 5/45 | |
High temperature cauteriser | Bovie Medical | AA01 | |
MEDIA COMPOSITION | |||
Media composition is detailed below. HIDEMs growth medium:
|
|||
Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media.